依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂的制备及体内外评价

发布时间：2020-05-19 12:47

【摘要】：淋巴瘤是一种严重威胁人类健康的疾病,对于难治性或复发性患者,高剂量化疗后自体干细胞移植是临床标准治疗方法。化疗药物依托泊苷(简称VP16或EPEG)被推荐为淋巴瘤高剂量化疗一线治疗药物。其作用机理为干扰DNA拓扑异构酶Ⅱ,间接诱导DNA断裂,从而阻滞肿瘤细胞于晚S期和G2期。目前VP16的上市制剂有软胶囊和注射液,其中软胶囊剂口服每天50 mg,一天一次;VP16注射液规格为100mg(5mlL);500mg(25mL);1g(50 mL)三种。VP16上市制剂在临床应用中由于药物溶解性差、较严重的胃肠道反应和剂量限制性毒副作用等问题导致淋巴瘤治疗高剂量给药难以实现。因此,急需开发VP16新剂型解决上述问题。近年来,纳米药物的快速发展对肿瘤的治疗表现出巨大的应用潜力。脂质纳米混悬剂(LNS)作为纳米给药系统中极具发展前景的一种剂型,具有以下独特的优势:①选用脂类材料作为稳定剂,毒性低,生物相容性和安全性较好;②脂质纳米混悬剂的载药量较高,无药物泄露问题,从而可减小给药体积,尤其适用于VP16这种临床应用剂量大的难溶性药物;③处方中只含有适量的稳定剂,避免了大量刺激性辅料的应用,可大大降低毒副作用,提高病人顺应性;④可利用纳米制剂的增强渗透与滞留效应(EPR effect)增加药物在肿瘤部位的蓄积,在增强抗肿瘤作用的同时降低药物对正常组织的毒副作用;⑤脂质纳米混悬剂的处方及工艺简单可行,更适合工业化大生产。本研究首次以大豆卵磷脂和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)为稳定剂制备依托泊苷脂质纳米混悬剂(VP16-LNS)作为静脉注射用纳米制剂,以期解决VP16上市制剂中药物溶解性差、临床给药剂量大导致注射体积大以及刺激性辅料的应用使患者顺应性差等问题,在增强淋巴瘤治疗效果的同时降低毒副作用。本课题的主要研究内容与结果如下:1.VP16含量测定方法的建立本课题采用HPLC法建立了 VP16体外含量测定方法,对方法的专属性、检测限与定量限、线性、日内日间精密度、方法回收率和加样回收率进行了考察。结果表明此方法专属性强,VP16浓度在25～500 μg/mL范围内峰面积A与浓度C线性关系良好,精密度和回收率也均符合含量测定方法学的要求。因此,可以采用HPLC法测定VP16的含量。2.VP16-LNS的处方优化及体外性质评价本课题采用纳米沉淀法制备VP16-LNS,通过单因素考察和正交设计筛选最优处方与工艺条件,以最优处方工艺制备三批VP16-LNS并进行理化性质评价,主要包括制剂外观、微观形态、粒径大小、zeta电位和载药量等。通过在VP16-LNS中加入6%(w/v)的甘露醇作为冻干保护剂制备VP16-LNS冻干制剂,以进一步提高制剂的稳定性便于储存和运输。差示扫描量热法和X射线衍射法考察冻干制剂的晶型结构。采用动态膜透析法考察VP16-LNS在pH 7.4 PBS(含1%吐温-80,w/v)中的释放行为。通过测定VP16-LNS在不同介质中的粒径变化考察其稳定性。采用体外溶血实验考察VP16-LNS的初步安全性以评价其是否适用于静脉注射给药。最后,以Raji人源淋巴瘤细胞及A20鼠源淋巴瘤细胞为细胞模型,采用MTT法考察VP16-LNS的体外细胞毒性。实验结果表明,最优处方制备的VP16-LNS成球形或类球形颗粒,粒径分布均匀,平均粒径为(87.50士 7.44)nm,PDI 为 0.224±0.039,zeta 电位为(-7.38±0.26)mV,载药量为(6.81 ±0.30)%。VP16-LNS冻干制剂呈均匀细腻疏松多孔的白色粉末且再分散性良好,差示扫描量热法和X射线衍射法证明VP16-LNS的冻干制剂以无定型或非晶型状态存在。体外释放结果表明VP16-LNS在前5h内VP16累积释放量高达80%以上,随后缓慢释放。体外稳定性实验表明VP16-LNS在pH 7.4 PBS,细胞培养基PRMI 1640及血浆中的稳定性良好。体外溶血实验结果显示VP16-LNS未发生溶血现象,适宜静脉注射给药。MTT结果表明VP16-injection和VP16-LNS对两种淋巴瘤细胞具有明显的浓度依赖性细胞毒性。此外,VP16-LNS在Raji和A20两种淋巴瘤细胞上的IC50值分别为 0.508 μg/mL 和 0.219 μg/mL,VP16-injection 的 IC50 值分别为 0.735 和0.531,VP16-LNS在Raji和A20两种淋巴瘤细胞上的IC5C值显著低于VP 16-injection(p0.05)。3.VP16-LNS的体内性质评价以雌性昆明小鼠为动物模型,采用HPLC法考察VP 16-LNS和VP16-injection尾静脉注射后在小鼠体内的药代动力学特性,并用DAS 2.0软件处理药代动力学参数。采用近红外活体荧光成像技术,选用亲脂性近红外荧光染料DiR碘化物代替VP 16制备DiR-LNS,观察小鼠尾静脉注射DiR-LNS后体内药物分布情况。以荷A20鼠源淋巴瘤的雌性BALB/c小鼠为动物模型,评价VP16-LNS的体内抗肿瘤活性。此外,本课题通过对不同处理组小鼠的体重变化、脏器系数、外周血象、肝肾指标、各器官组织病理切片、新西兰兔耳缘静脉刺激性等进行考察,评价VP16-LNS的体内安全性。药动学研究结果表明,与VP16-injection相比,VP16-LNS可显著提高小鼠体内血浆中药物浓度,VP16-LNS给药组的药动学参数t1/2β、AUC0-t、AUMC0-t,和MRTo-t相比VP16-injection组分别提高到其6.37倍、1.87倍、6.14倍和3.00倍,CL 减小到 VP 16-injection 的 48%,结果表明与 VP16-injection 相比,VP 16-LNS可减慢VP16的体内清除速度并显著延长体内循环时间,有利于增强抗肿瘤作用。体内近红外荧光成像结果表明,DiR-LNS组小鼠相比游离DiR组肿瘤部位显示出更强的荧光信号,是游离DiR的5.21倍,提示LNS可显著提高药物在肿瘤部位蓄积。体内药效学研究结果表明,VP16-LNS组小鼠肿瘤体积显著小于VP16-injection组(p0.05),并且VP16-LNS组的平均瘤重显著低于其他治疗组,VP16-LNS(25mg/kg)组的肿瘤抑制率高达93.68%(p0.01),不同治疗组肿瘤组织HE、Ki-67和TUNEL染色结果也证明VP16-LNS可显著增强淋巴瘤的治疗效果(P0.05)。小鼠体重变化、脏器系数、外周血象、肝肾指标、各器官组织病理观察、新西兰兔耳缘静脉刺激性的实验结果表明VP16-LNS相比VP16-injection具有更高的安全性。综上所述,本研究制备的VP16-LNS形态圆整、粒径小且分布较均匀,载药量高。并且制备工艺简单可行,重现性好,能够改善VP16的溶解性,延长血液循环时间,增强抗肿瘤效果并具有较低的毒副作用,表明VP16-LNS是一种具有潜力的淋巴瘤治疗剂型,具有广阔临床应用前景。
【图文】：

色谱图,紫外扫描,图谱,末端吸收

１．１确定检测波长逡逑用紫外－可见分光光度法将ＶＰ１６标准溶液在２００￣４００邋ｎｍ波长范围内进行紫逡逑夕卜可见光谱扫描，结果如图１－１所示：逡逑１邋咖逦逡逑１！：逡逑０邋８００逦＼逡逑＼逡逑＼逡逑０邋６００逦＼逡逑０邋？０丨逡逑０邋２００邋／逦２８４邋００逡逑／邋！逦＾逦逡逑0000｜逦、逡逑２００邋００逦Ｘ邋００逦３００邋０Ｃ逦３５０邋００逦ＷＯＯＤ逡逑波长１？１逡逑图１－１邋ＶＰ１６紫外扫描图谱（见实验记录Ｎｏ：０００４０５４－ｐ３）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ＵＶ邋ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＶＰ邋１６逡逑由ＶＰ１６紫外吸收图谱可以看出，其在波长２１０邋ｎｍ和２８４邋ｎｍ有吸收峰，在逡逑２］０邋ｎｍ出现的吸收峰为末端吸收，由于末端吸收容易造成背景基线高，使得信逡逑噪比下降，从而降低检测的灵敏度，所以不能选择２１０邋ｎｍ作为检测波长。查阅逡逑２０１５年版《中国药典（二部）》第６６３页ＶＰ１６含量测定方法，其检测波长为２５４逡逑ｎｍ。结合上述紫外扫描图谱可知，２８４邋ｎｍ处的紫外吸收比２５４邋ｎｍ处相对弱一逡逑些，所以最终检测波长确定为２５４邋ｎｍ。逡逑１．２专属性考察逡逑ＶＰ１６标准溶液、辅料溶液分别进高效液相色谱仪并记录色谱图。结果见图逡逑１－２，，邋ＶＰ１６在１３．７８６邋ｍｉｎ出现了吸收峰，而辅料溶液在此时间并未出现任何吸收逡逑峰

辅料,标准溶液,峰面积,溶液

采用ＨＰＬＣ法测定一系列标准溶液峰面积，记录结果如表１－１所示。以峰面逡逑积（Ａ）为纵坐标，浓度（Ｃ）为横坐标，将峰面积Ａ对其浓度Ｃ进行线性回归逡逑并绘制标准曲线，结果见图１－３。回归方程为：Ａ＝１０．８８６Ｃ－１９．４２１邋（Ｒ２邋＝邋０．９９９８）。逡逑结果表明，ＶＰ１６在２５？５００邋ｎｇ／ｍＬ浓度范围内，峰面积Ａ与浓度Ｃ线性关系良逡逑好。逡逑表１－１不同浓度的ＶＰ１６溶液峰面积测定结果（见实验记录Ｎｏ：０００４０５２－ｐ３）逡逑Ｔａｂ．邋１－１邋Ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｅａｋ邋ａｒｅａ邋ｏｆ邋ＶＰ邋１６邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ逡逑Ｃ邋（＾ｉｇ／ｍＬ）邋２５逦５０逦１００逦２００逦３００逦５００逡逑峰面积（Ａ）逦２６４．６逦５３２．４逦１０２２．７逦２１６５．１逦３２８３．４逦５４０６．５２逡逑２６逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

【参考文献】