人类P450酶对药物及外源物的代谢研究

发布时间：2020-05-19 14:15

【摘要】：随着现今医药事业的发展以及人类的生活健康水平的不断提高,药物的研发不再单单注重药物的创新性,其研究重点也逐渐向药物的药代动力学性质靠拢。现今要判断一个药物是否有应用前景特别是市场前景,疗效和毒副作用虽然仍然是最关键的因素,但决不是判断的全部因素。现在的药物研发部门越来越重视新药物是否能具备良好的药代动力学性质,否则即使药物具备疗效也不能成功在人体内部发挥功效,甚至会在体内堆积毒素。例如典型的肽类药物,许多生物活性肽,例如内啡肽等均具有高效低毒的特点,但是由于在体内不稳定,口服该类药物不能起到任何效果。因此,药代动力学的研究在药品的研发阶段是十分重要的一个环节。药代动力学是主要研究药物进入人体的过程,基本过程包括药物的吸收,分布,代谢和排泄。本文意在研究药物代谢过程,特别是外源物质的代谢。细胞色素P450(又简称CYP)是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶,由于该酶在450nm有最大紫外吸收峰,因此该类酶被称为P450。细胞色素P450主要分布于肝脏,同时某些P450酶在小肠,肾脏,肺和大脑中也有少量分布表达。由于大约90%的药物都经由细胞色素P450代谢,因此对于药物代谢的研究领域则大部分都聚集在研究细胞色素P450上。细胞色素P450可催化体内多种反应,包括氧化还原反应,环氧化反应,N-脱羟基反应,O-脱羟基反应,S-氧化和羟基化反应等等。细胞色素P450可代谢大约25万种外源性物质,包括药物,环境中的化合物和污染物,自然界中植物产物,杀虫剂,卤化烃,多环芳香烃、芳基胺、燃烧的成分,除草剂等等。本课题主要包括两大部分:甾体类兴奋剂的代谢和细胞色素3A家族酶的底物和抑制剂的筛选探究。其中,对于甾体类兴奋剂,意在合成该兴奋剂的在人体中的代谢物,从而作为世界反兴奋剂机构尿检结果的参照标准品。而对于细胞色素3A家族酶,意在探究其中四种同工酶CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43的特异性底物,活性表征及抑制作用,从而为细胞色素P450研究领域提供更多的信息。兴奋剂,原英文名称为“Dope”,原义是指“供赛马时使用的一种鸦片麻醉混合剂”,多指刺激剂类的药物。而禁用药物,是指运动员为提高比赛成绩或延缓训练强度而服用的一类药物的总称,所含类别也由之前的四大类扩大到七大类,其中包括刺激剂、麻醉止痛剂、合成类固醇类、利尿剂、β-阻断剂、内源性肽激素及血液兴奋剂。而事实上,国际上所说的兴奋剂则指全部禁用类药物,而不仅仅指可以起到兴奋作用的刺激剂。但现今,兴奋剂的范围则变得更为广泛,概念也更为严格,甚至一些为了提高比赛成绩而使用的不正当的方法或心理手段,现今也被纳入兴奋剂的范畴。国际运动医学会的国际兴奋剂会议将兴奋剂的概念定义:参加竞赛的运动员使用任何异体物质,或以不正常的量和不正常的进入机体的途径使用生理物质,试图人为地以不正当方式提高其竞赛成绩的行为,这些物质则都被称为兴奋剂。2018年平昌冬奥会俄罗斯全队由于兴奋剂而被禁赛,可见,兴奋剂的滥用已经造成了很恶劣的影响,关于反兴奋剂的斗争也一直进行着。对于反兴奋剂工作的进行,对运动员尿液中兴奋剂残留物的检测则始终是反兴奋剂的工作重点之一。随着分析检测仪器的发展,特别是色谱-质谱联用技术的进步,使得复杂生物基质中的微量成分可以被精确测定,并极大促进了兴奋剂检测手段的进步。目前,兴奋剂检测的主要方法有气相色谱、高效液相色谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用技术等等。本研究课题的第一部分是关于兴奋剂代谢的研究。在众多类型的兴奋剂中,合成代谢雄激素类固醇(AAS)在体育竞赛中被以刺激剂而被频繁地滥用。本课题对合成代谢雄激素类固醇之一的兴奋剂代谢进行研究,意在体外合成4-脱氢氯甲基睾酮(DHCMT,化学名称:4-氯-17β-羟基-17α-甲基雄甾-1,4-二烯-3-酮,商标名称:特力补)的长期代谢物。关于该种兴奋剂的研究表明,其存在多种类型的代谢物,其中一种为长期代谢物20βOH-NorDHCMT(4-氯-17β-羟甲基-17α-甲基-18-去甲雄甾-1,4,13-三烯-3-酮),顾名思义该类代谢物存在于尿液中可被检测的时间可长达给药22天后,换言之,即使是在长时间服用该兴奋剂后,依然可在尿液中检测到其残留的代谢物,从而判定运动员是否有服用禁用药物。然而,到目前为止,并没有已纯化的长期代谢物作为参照标准品,因此本课题的目的则在于合成纯化出20βOH-NorDHCMT。其中,本文通过Wagner-Meerwein重排反应处理DHCMT,随后利用表达可表达人CYP21A2的重组裂殖酵母菌株进行全细胞生物转化,并通过发酵技术和制备液相色谱技术合成纯化出毫克量的该代谢物,以液质联用及气质联用技术为检测手段,对纯化出的代谢物进行表征,最终将表征结果与给药后的尿液样本进行分析对照。结果显示体外通过化学生物法合成的长期代谢物与给药后的尿液检测到的残留物为同种物质,因此可用作反兴奋剂机构的参照标准品,且该方法可作为生产20βOH-NorDHCMT标准品的方法之一。该课题所提供的参照标准品将为今后赛场上DHCMT的滥用提供无可置疑的证据。涉及药物代谢的细胞色素P450主要为CYP1、CYP2、CYP3家族中7种重要的亚型:CYP1A2(占P450代谢药物的4%)、CYP2A6(2%)、CYP2C9(10%)、CYP2C19(2%)、CYP2D6(30%)、CYP2E1(2%)、CYP3A4(50%)。其中,CYP3A家族是分布最广泛,研究最多的一类细胞色素。CYP3A家族同工酶大部分分布在人体肝脏和小肠内,包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43,四种酶总量平均可以占到人体肝脏内全部CYP系统的大约30%左右。而现今市上所售的大多数氧化型的药物都至少可以被部分CYP3A家族的酶代谢。在CYP3A家族中,CYP3A4是主要的成人型亚型,主要在人的肝脏和小肠表达。CYP3A5在大约20%的人群中呈多态性表达,而CYP3A7只在胎儿肝脏表达,当然在某些成人体内也可以找到CYP3A7的存在。而对于CYP3A43,这是近些年才刚刚发现的一种酶,因此对于它的性质以及它在人体药物代谢方面的意义的研究非常有限,即使有也是鲜有报道。因此在本课题中,CYP3A43也是CYP3A家族部分的研究重点。现今关于CYP3A43,大部分的研究都是关于CYP3A43与前列腺癌发病原因的关系探究,而对于CYP3A43酶活性的研究,特别是对其特异性底物和抑制剂的探究则一直是这个领域的缺口。因此在本课题中,则重点为CYP3A43筛选了特异性底物和抑制剂,并且尝试探究如何提高其代谢活性。由于许多药物和外源性的化学物质都是CYP3A重要的底物,因此酶在药物的相互作用的影响不得不考虑。在药物代谢的相互作用中,酶抑制引起的药物相互作用占全部相互作用的70%,酶诱导引起的相互作用约占23%,其他则占7%。而在众多的药物不良反应中,细胞色素P450酶抑制作用则是引起药物不良反应的最常见原因。因为当一种药物可以抑制人体的某一种细胞色素P450时,可被该种P450酶代谢的另一种药物的清除率便会相应降低,其半衰期则会随之延长,导致该种药物血药浓度增加,严重时可导致内脏毒性。换言之,药物对酶的抑制作用会影响到酶对其他药物的代谢清除作用,从而导致毒性产生。这就是研究酶抑制作用的必要性。事实上,在人体内CYP3A家族中各种酶的表达和活性都有很明显的个体差异,像年龄、性别、种族等都会成为产生差异的因素。因此对于CYP3A家族的研究始终具有很大的现实意义,也具备很大的研究潜力。本课题的第二部分则是关于细胞色素P450酶中CYP3A家族中所包含的四种同工酶(CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43)的活性与抑制作用的探究。该部分意在为57种细胞色素的代谢活性及抑制作用的集合提供数据。由于细胞色素P450可以代谢市面上90%的药物,企业在药物研发环节中不可避免的会涉及到对P450活性及抑制作用信息的集合。例如在检测新药品是否会由于P450的代谢而产生毒性时,又或者是在众多P450中筛选某种酶的特异性抑制剂时,因此对全部57种细胞色素P450的活性与抑制作用信息的总结是十分必要的,从而可以随机混合几种P450,利用“鸡尾酒法”可以快速筛选酶特异性底物或抑制剂,但现今并未见有关于此的报道。本课题组拥有可以表达这57种人P450的重组裂殖酵母菌株;且具备成熟的可以快速筛选底物和抑制剂的方法,即渗透重组裂殖酵母法,亦称酶包法;更具有大量多种类的发光底物及常用抑制剂,因此可以完成全部57种细胞色素P450的活性与抑制作用信息的总结。本文则主要研究细胞色素P450酶中CYP3A家族的四种酶对两种发光底物(Luciferin H和Luciferin ME)活性测定及三种常见抑制剂(酮康唑、来曲唑、苄基咪唑)的抑制度测定,但由于CYP3A43是CYP3A家族中研究最少的一种酶,关于其特异性底物和抑制剂的相关研究都很少,因此对CYP3A43进行了六种发光底物(Luciferin H、Luciferin ME、Luciferin IPA、Luciferin PFBE、Luciferin BE和Luciferin PPXE)的筛选。研究发现,CYP3A5与CYP3A7均可以代谢Luciferin H和Luciferin ME,CYP3A4可代谢Luciferin H。且CYP3A7对Luciferin H代谢活性最高,CYP3A5对Luciferin ME的代谢活性更高;CYP3A43可以代谢Luciferin PPXE。但由于CYP3A43对Luciferin PPXE的代谢活性较低,本课题构建可以表达细胞色素B5(CytB_5)及细胞色素B5还原酶(CytB_5R)的重组菌株,CYP3A43对Luciferin PPXE的代谢活性可被提高约46%。综上所述,本文针对细胞色素P450对外源物质的代谢进行了一定程度上的研究,课题主要分为两大部分,围绕细胞色素P450对兴奋剂的代谢以及对发光底物的代谢进行探究,丰富了细胞色素P450领域的研究内容。对于细胞色素P450代谢兴奋剂部分,本课题最终在体外用化学生物结合法成功合成4-脱氢氯甲基睾酮(DHCMT)的长期代谢物20βOH-NorDHCMT,并作为检测4-脱氢氯甲基睾酮的参照标准品,为运动员在比赛场上对该种兴奋剂的滥用提供了坚实的证据,从而为世界反兴奋剂的斗争贡献出了自己的一份力量。关于CYP3A家族同工酶活性和抑制作用的探究,研究发现CYP3A5与CYP3A7均增加了两种可被代谢的发光底物Luciferin H和Luciferin ME,CYP3A43增加了一种可被代谢的发光底物Luciferin PPXE,并且发现可同时表达人细胞色素P450氧化还原酶(CPR)、人细胞色素B5(CytB_5)及细胞色素B5还原酶(CytB_5R)三种还原酶的重组裂殖酵母菌株可以增强细胞色素P450对特异性发光底物的代谢强度。该项研究为细胞色素P450领域关于活性以及抑制作用的研究范围丰富了数据,特别是发现了CYP3A43的一种新发光底物,为今后CYP3A43的研究提供了新素材,同时为药物研发企业运行“鸡尾酒法”打下了一定的基础。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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