二十二碳六烯酸（DHA）的抗肿瘤活性与GPR120受体之间的关系研究

发布时间：2020-05-19 15:24

【摘要】：G蛋白偶联受体属于膜蛋白家族,可以把细胞外信号传递到胞内,通过介导多种效应系统引起细胞内的一系列反应,在激素分泌、细胞增殖、凋亡以及细胞分化成熟等方面都发挥着重要作用,因此G蛋白偶联受体是临床治疗疾病的重要靶点之一。G蛋白偶联受体120(G protein-coupled receptor 120,GPR120),又称游离脂肪酸受体4(FFAR4),是G蛋白偶联受体中视紫红质家族的一种,近年来通过对其配体的研究,发现GPR120参与介导脂肪细胞的分化成熟、胰岛素分泌、细胞的增殖凋亡以及抗炎等多种生理活动,目前也是治疗Ⅱ型糖尿病、肥胖症的重要研究靶点。G蛋白偶联受体40(GPR40)又称游离脂肪酸受体1(FFAR1),GPR40和GPR120结构相近,具有典型的G蛋白偶联受体的七次跨膜结构,虽然两者都可以被游离脂肪酸激活,但是两者在不同种类细胞的细胞膜上表达水平存在差异,生物学功能也不尽相同。激活GPR40信号通路会促进肺癌细胞增殖与迁移,而GPR120起负向调控作用,但在骨肉瘤细胞中两者作用相反。深入研究GPR120功能对肿瘤的预防和治疗具有重要指导意义。在细胞内游离脂肪酸通过β-氧化可以为机体提供能量和维持生命体正常运行的中间体,同时也可以作为内源性配体,激活胞内或膜上受体,参与信号转导。GPR120可以被中链和长链的脂肪酸活化。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一种ω-3不饱和脂肪酸,主要存在植物和鱼油中,是GPR120和GPR40的配体,具有多种生物学活性。研究发现DHA通过GPR120抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡;但也有研究报道DHA的抗肿瘤作用与GPR120没有必然关联。由于机体微环境的差异以及肿瘤的多样性,作为GPR120配体的DHA的生物学功能以及潜在的机制还有待研究。DHA具有抑制肿瘤增殖以及促进细胞凋亡的生物学功能,而GPR120信号通路又和多种肿瘤的发生发展密切相关,另外DHA又是GPR120的配体,故本课题的目的是研究DHA对肺癌细胞的生物学功能的影响以及DHA是否通过GPR120受体发挥生物学作用,为此本课题主要研究了 DHA对肺癌细胞增殖、凋亡以及侵袭转移的影响,以及借助于GPR120小分子选择性激活剂和抑制剂,研究DHA的抗肿瘤活性与GPR120受体的关系。本课题主要运用SRB实验、Transwell实验、划痕实验以及流式细胞术等技术方法,研究DHA对H460肺癌细胞株的生物活性的影响,研究GPR120受体被选择性抑制剂AH-7614或者激活剂TUG-891作用后DHA的抗肿瘤活性是否发生变化。本论文结果显示DHA抑制H460肺癌细胞的增殖,并呈现浓度依赖性;DHA对H460细胞迁移的划痕实验结果表明DHA能够抑制H460肺癌细胞的迁移,90 μmol/L的DHA具有明显的抑制特性,且随浓度升高而增强。本研究未发现DHA对H460细胞具有凋亡诱导作用。GPR120在选择性抑制或激活的情况下,DHA对H460细胞的增殖抑制具有明显增强作用,但并无显著性差异。抑制剂AH-7614和激活剂TUG-891对H460细胞迁徙转移不具有显著性抑制作用,然而抑制剂AH-7614可以明显增强DHA对细胞迁徙转移的抑制作用,激活剂TUG-891不影响DHA对细胞迁徙转移的抑制作用。结果可能预示着在H460细胞株中DHA的抗肿瘤活性可能不通过GPR120受体,但具体机制还需进一步验证。为深入研究DHA与GPR120受体之间的关系本课题构建了 GPR120基因敲除质粒载体,然后包装成病毒颗粒,感染细胞后经筛选和鉴定,获得3个GPR120基因敲除的H460肺癌细胞株;构建了 GPR120高表达质粒载体,并通过转染细胞,获得3个GPR120高表达的稳定转染A549肺癌细胞株;GPR120基因敲除和高表达的细胞株的分别获得为深入研究DHA与GPR120受体之间的关系奠定了基础。
【图文】：

ｃｒＲＮＡ对外源基因识别、ｔｒａｃｒＲＮＡ对相关的核酸内切酶的靶向招募，ＣＲＩＳＰＲ相逡逑关的核酸内切酶发挥核酸编辑作用，对外源基因进行酶切，其中ｃｒＲＮＡ和逡逑ｔｒａｃｒＲＮＡ己经被人为的融合成了单一的合成导向ＲＮＡ邋（ｓｇＲＮＡ），如图１－１＿。逡逑其中ＰＡＭ是一个核苷酸串联鸟嘌呤核苷ＮＧＧ位点，与基因编辑定位相关，在逡逑其上游大概３ｂｐ位置，Ｃａｓ９蛋白发挥酶切编辑功能［２９］。运用该系统进行基因编逡逑辑操作简单，价格低廉，相比较锌指核酸酶编辑系统具有更高的诱变效率，而且逡逑具有更低的脱靶情况［２６］。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９目前已经运用到了真核生物的基因编辑逡逑中，随着这一系统的完善，有望运用到人体的基因治疗方面［３１］。逡逑１０逡逑

倒掉染色液，用１邋％（Ｖ／Ｖ）现配的乙酸溶液清洗４次，室温自然晾干，大概２ｍｉｎ；逡逑（９）每孔加入Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ碱溶液１５０邋｜ｉＬ邋（１０邋ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝１０．５）溶解细胞的染料，，放置在水平摇床２０邋ｍｉｎ，酶标仪５４０邋ｎｍ检测吸光度。逡逑３．实验结果逡逑３．１不同细胞株ＧＰＲＩ２０和ＧＰＲ４０的蛋白表达水平的测定逡逑培养细胞并收集蛋裂解液进行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ实验，发现在肝癌细ＨｅｐＧ２、乳腺癌细胞４Ｔ１和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１邋（图中为２３１）、肺癌细胞Ｈ１２９９Ｈ４６０、人神经母细胞瘤细胞ＳＹ５Ｙ以及人结肠癌细胞ＨＣＴ１１６中，ＧＰＲ４０ＧＰＲ１２０均有表达，且在不同细胞间蛋白表达水平存在差异，如图２－１所示。逡逑ＧＰＲ４０ｍｍｍ橚＿丨＿逦逦逦逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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本文编号：2671089