Dacomitinib逆转ABCG2介导的肿瘤多药耐药作用及其机制研究

发布时间：2020-05-20 00:07

【摘要】：研究背景及目的化疗是治疗肿瘤的主要方法之一,而化疗引起的多药耐药是成功化疗的主要障碍。ATP结合盒膜通道转运蛋白可以利用能量把抗肿瘤药物排出细胞外从而产生多药耐药性。ABCG2是ABC家族常见转运蛋白之一,ABCG2属于半转运体由一个6个跨膜结构域和一个位于N-末端的ATP结合盒组成。ABCG2在肿瘤细胞膜上过度表达时会结合底物抗癌药物,同时ATP结合到ABCG2的ATPase结合位点,水解ATP释放能量使化疗药物被泵出胞外。降低细胞内药物的浓度从而使肿瘤细胞获得耐药性。因此抑制ABC蛋白转运体功能是克服多药耐药的一个有效的方法。然而,至今还没有安全有效的多药耐药的逆转剂被批准用于临床。近年来,一些酪氨酸激酶抑制剂相继被发现可以逆转ABC蛋白过表达引起的多药耐药。Dacomitinib是第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂,对EGFR突变的非小细胞肺癌有很好的疗效,并已经被批准用于临床。由于有报道酪氨酸激酶抑制剂同时可以逆转多种ABC蛋白介导的多药耐药,本文主要研究dacomitinib逆转ABCG2转运蛋白过表达引起的多药耐药作用。研究方法细胞毒性测定用和体内逆转倍数评估使用MTT法;以H460/MX20细胞建立裸鼠移植瘤模型探讨dacomitinib体内逆转活性;蛋白测定用Western blotting;ABCG2的m RNA表达水平用RT-PCR法测定;Dox,Rho 123,hoechst33342积累、Rho123外排和ABCG2的膜蛋白表达用流式细胞仪测定;钒敏感法测定dacomitinib对ABCG2 ATPase活性;[125I]-IAAP光亲和标记实验探讨dacomitinib和ABCG2的作用位点情况。结果Dacomitinib能够浓度依赖性地增加ABCG2底物拓扑替康和MX对ABCG高表达细胞S1-M1-80和H460/MX20的细胞毒性,1μM dacomitinib显著逆转S1-M1-80和H460/MX20细胞对拓扑替康和MX的耐药性,但dacomitinib不改变亲本细胞S1和H460细胞对拓扑替康和MX的药物敏感性。Dacomitinib对ABCB1介导的MDR无明显逆转作用。在1μM dacomitinib与Dox联用时,对KBv200细胞产生微弱的协同细胞毒作用。Dacomtinib在较低浓度下能明显激活ABCG2 ATPase活性,并能与[125I]-IAAP竞争性的与ABCG2结合,表明dacomitinib可能是ABCG2底物。dacomitinib(5 mg/kg,p.o)显著增加拓扑替康的效果;在以H460/MX20细胞建立的MDR裸鼠移植瘤模型中dacomitinib显著提高拓扑替康的抗肿瘤活性,而dacomitinib或拓扑替康单独给药组则无明显抑瘤作用。所有实验组的老鼠均未发现明显毒副作用。Dacomitinib浓度依赖性地增加Dox和Rho123在S1-M1-80细胞中的积累,但对Dox和Rho 123在亲本细胞S1中的积累无明显影响;Dacomitinib浓度依赖性地增加hoechst 33342在H460/MX20细胞中的积累,但对hoechst 33342在亲本细胞H460中的积累无明显影响。Dacomitinib显著抑制S1-M1-80细胞对Rho123的外排作用;Dacomitinib对ABCG2的蛋白和m RNA表达水平没有影响。表明dacomitinib通过抑制ABCG2介导的药物外排功能恢复ABCG2高表达MDR细胞对化疗药物的敏感性。在S1-M1-80、S1、H460和H460/MX20细胞中dacomitinib对AKT和ERK的磷酸化水平没有显著的阻断作用,表明dacomitinib恢复ABCG2高表达的MDR细胞对化疗药物的敏感性不依赖于dacomitinib对酪氨酸激酶受体下游信号通路磷酸化的阻断作用。结论:1.Dacomitinib在体外和体内逆转ABCG2介导的MDR,对ABCB1介导的MDR则无明显逆转作用。2.Dacomitinib通过与ABCG2直接作用抑制ABCG2药物外排泵功能发挥逆转作用,是有开发前景的第三代逆转剂。3.Dacomitinib通过抑制ABCG2药物外排泵功能在体内和体外逆转ABCG2介导的多药耐药,这种逆转作用不依赖于dacomitinib对ERK和AKT的磷酸化的阻断作用。4.Dacomitinib通过抑制ABCG2药物外排泵功能逆转ABCG2介导的耐药,对指导dacomitinib临床联合ABCG2底物化疗具有一定意义。
【图文】：

细胞毒性试验,细胞,胶片,细胞毒

若有明显发光则 1 min 即可）。打^u胶片夹，拿出胶片放入胶片显影仪中冲洗。2. 统计分析所有实验均重复至少 3 次，数据显示为平均值±SD。本研究用 SPSS 16.0分析数据，统计学差异用 Student’s t 检验进行分析，当 P<0.05 时有统计学差异。3. 结果3.1 Dacomitinib 的细胞毒性试验我们首先测定dacomitinib在本研究所用细胞株KB、KBV200(图1 a)、H460、H460/MX20( 图 1b) 、 S1 、 S1-MI-80( 图 1c) 、 HEK293/pcDNA3.1 、HEK293/ABCG2-482-T7 和 HEK293/ABCG2-482-R2 (图 1 d、e)的细胞毒，如图1 所示 dacomitinib 在 1 μM 时，本研究所用细胞存活率均 >80%。然后我们选用1，0. 5 和 0.25 μM 3 个浓度梯来用于接下来的逆转实验。

趋势图,拓扑替康,累积水平,小鼠

Dacomitinib 增加拓扑替康的抗癌效果在 H460/MX20 小鼠移植瘤模型中。(a)肿瘤生长体积趋势图(n =7) (b)25 天后小鼠取下的肿瘤图像(c)在给药过程中每组小鼠平均体重的改变(d)每组小鼠的平均瘤重。* p< 0.05, ** p< 0.013.6 Dacomitinib 增加 Dox、Rho123 和 hoechst 33342 在 ABCG2 过表达细胞中积累以上数据表明了 dacomitinib 在体内和体外都可以显著地增加过表达ABCG2 的肿瘤耐药细胞的对传统底物化疗敏感性。如图 3 所示，耐药细胞S1-MI-80 内 Dox 和 Rho 123 的积累水平明显低于亲代 S1 细胞。分别用 0. 25，0.5 和 1 μM 的 dacomitinib 处理细胞后，，Dox 和 Rho 123 在 S1-MI-80 细胞中的累积明显增高。与阳性对照 FTC 组中 Dox 和 Rho 123 的累积水平相近。而dacomitinib 没有改变 S1 细胞株中 Dox 和 Rho 123 的累积水平。染料 hoechst
【学位授予单位】：湖北科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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