载姜黄素杂化纳米粒制备及药效学评价

发布时间：2020-05-20 11:26

【摘要】：癌症是目前威胁人类生命健康的主要疾病之一。目前治疗癌症的药物存在副作用大、靶向性差、生物利用度低等问题。近年来兴起的纳米给药系统可以提高药物的溶解度、改善药物的靶向性,增加药物的生物利用度,增加药物的抗肿瘤效果。鉴于此,本课题试图开发基于蛋白内切酶特异性多肽和星状聚环脂为载体的杂化纳米给药体系,利用酶靶向性多肽提高对过表达MMP-2和MMP-9酶的肿瘤细胞的靶向性,并提高纳米粒穿透细胞的能力;以星状聚环脂构架提高载药量,同时增加纳米粒的水溶性以提高药物的稳定性和体内循环时间,并以微流控连续成粒技术制备其杂化纳米粒和粒径控制。课题首先设计并制备了两种功能化星状聚己内酯高聚物:两亲性三链高聚物Tri-CL-mPEG和酶靶向性四链高聚物PET-CL-P。以1,2,3-丙基三甲酸为核心,ε-己内酯为聚合单体,通过开环聚合反应制备星状高聚物,再以mPEG为亲水嵌段,通过酯化反应进行修饰,得到两亲性三链高聚物Tri-CL-mPEG。以季戊四醇为核心,ε-己内酯为聚合单体,通过开环聚合反应制备星状高聚物,再用酶靶向性多肽(ACP-GPLGIAGQr_9-ACP)进行修饰,得到酶靶向性四链高聚物PET-CL-P。经傅立叶红外光谱法(FT-IR)、氢核磁共振谱法(~1H-NMR)和凝胶渗透色谱法(GPC)等方法,对高聚物进行结构表征。为实现纳米粒制备的均一性和可重现性,本课题采用微流控连续成粒技术制备了杂化纳米粒。以姜黄素为模型药物,将设计合成的载体材料Tri-CL-mPEG、PET-CL-P和姜黄素按一定比例溶解于丙酮,作为油相,以纯化水作为水相,采用精密注射泵分别将油相和水相注入主通道和支通道,在十字型微通道设备中制备载姜黄素杂化纳米粒。通过单因素法考察得到最佳参数分别为:水相流速为1.20 mL/min、油相流速为0.60 mL/min、姜黄素浓度为1.00 mg/mL、材料比例为1:1和药材比为1:15。杂化纳米粒Cur-P-NPs的粒径约为126.0 160.0 nm。最佳参数条件下制备得到的杂化纳米粒Cur-P-NPs的粒径为(146.1±1.940)nm,多分散指数PDI为(0.175±0.014),Zeta电位为(10.1±0.300)mV,包封率为(74.66±0.671)%,载药量为(5.38±0.316)%。TEM结果表明,杂化纳米粒Cur-P-NPs为均一圆形,其粒径与马尔文粒径结果较为一致。XRD结果表明,姜黄素被包封于杂化纳米粒之中,而非吸附在纳米粒表面。体外释放结果表明,随着pH的降低,杂化纳米粒Cur-P-NPs的释放越快。体外稳定性结果表明,杂化纳米粒Cur-P-NPs可在4℃条件下稳定保存30天,在血清中7天内粒径和PDI没有明显变化,较为稳定。本课题选用成纤维细胞L929对空白纳米粒Blank-NPs和Blank-P-NPs进行材料毒性考察;采用人源酶联免疫检测试剂盒检测肿瘤细胞的培养基上清液,并根据其中MMP-2和MMP-9的含量筛选肿瘤细胞用于后续药效学考察;选用人胶质瘤细胞U251对姜黄素水溶液(Cur-Solution)、两亲性杂化纳米粒(Cur-NPs)和酶靶向性杂化纳米粒(Cur-P-NPs)的体外抗肿瘤细胞增殖效果进行考察。结果表明,在0.0175 1.4 mg/mL范围内,载体材料对L929细胞的毒性较小,符合用药安全性。U251细胞培养基上清液中MMP-2和MMP-9的含量均比A549细胞、MCF-7细胞和Hela细胞高。MTT毒性实验和细胞摄取实验结果均表明,与Cur-Solution和Cur-NPs相比,Cur-P-NPs更易被U251细胞摄取,对U251细胞的生长抑制更为明显。流式细胞术结果也表明,与Cur-Solution和Cur-NPs相比,Cur-P-NPs更多地被U251细胞摄取。本课题还构建了U251荷瘤小鼠模型,通过19天连续给药,结果发现Cur-P-NPs对肿瘤细胞的抑制效果最佳,Cur-NPs次之,Cur-Solution再次之。总之,本研究开发的载姜黄素酶靶向性杂化纳米粒具有制备简单、储存稳定的特点,通过物理混合,实现给药系统的多功能性。体内外抗肿瘤活性研究也表明,载姜黄素酶靶向性杂化纳米粒提高了姜黄素的生物利用度,具有明显的抗肿瘤效果,是一种具有临床应用前景的给药系统。
【图文】：

姜黄素

化性质科植物的根茎中提取得到的一个天然药物，黄素被美国 FDA 批准认定安全。姜黄素的药验证。临床研究表明，姜黄素的最大剂量可达，它对生物组织的毒性更小，也更健康。酚类结构，其化学结构如图 1-1 所示。姜黄素病毒、抗炎、抗增殖、免疫调节、抑制细胞周断不同类型的信号转导通路来抑制肿瘤细胞的、Ras、分泌型糖蛋白 Wnt β、丝裂原活化蛋ERK）、胞内磷脂酰肌醇激酶 PI3K 和蛋白激许多分子，如表皮生长因子受体 EGFR[13]、I白、肿瘤坏死基因 α（TNF α）[14]、金属蛋白酶l 2 and Bcl X[11]。姜黄素具有广谱抗癌作用，乳腺癌[18]、前列腺癌等[19, 20]。

季戊四醇,二氯甲烷,已内酯,辛酸亚锡

浙江工业大学硕士学位论文20图2-2 Tri-CL-mPEG的合成Figure 2-2. The synthesis of Tri-CL-mPEG（3）亲脂性四链高聚物 PET-CL 的合成称取季戊四醇（2 mmol，272.30 mg）和 ε-已内酯（120 mmol，13.70 g）加入100 mL 三口烧瓶，搅拌至季戊四醇溶解。在氮气保护下，加入辛酸亚锡（0.5 % wt），140 ℃下匀速搅拌，，反应 72 h。反应结束后趁热加入 10 mL 二氯甲烷，逐滴滴入100 mL 冰乙醚，减压过滤收集析出的白色沉淀。将滤饼溶解于 20 mL 二氯甲烷
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;R96

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