苯短期重复染毒对小鼠外周血单个核细胞及脾脏免疫功能的影响

发布时间：2020-05-23 02:03

【摘要】：目的:免疫系统是机体最重要的一道屏障,肩负着机体防御、监视、稳定等职能,免疫功能正常是机体健康的重要基石。苯是一种有毒的环境污染物,可以影响机体的免疫系统,并且引起造血系统恶性肿瘤。前人的研究表明多种途径可能参与这一过程,包括氧化应激,DNA损伤,细胞周期调节和程序性细胞死亡等,但是苯诱导的免疫毒性具体机制尚未完全阐明。本文拟通过构建苯染毒小鼠模型,从免疫器官、免疫细胞和免疫分子等多个水平研究苯染毒对小鼠外周血单个核细胞及脾脏的免疫毒性,为进一步探究苯的免疫毒性效应及其作用机制提供实验研究依据。方法:1.将40只6-8周龄的雄性无特定病原体级BALB/c小鼠随机分为4组:对照组(玉米油)、低剂量组(50mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)和高剂量组(500mg/kg),每组10只。每天经口灌胃1次,每周5天,连续4周。染毒期间每周观察记录小鼠体重变化,末次染毒24小时后进行各项指标的检测。2.采取小鼠的外周血进行血常规分析;使用酶联免疫吸附试验测定血浆中免疫球蛋白G、白介素-2和白介素-6的含量;使用Mito SOX荧光染料结合流式细胞术测定小鼠外周血单个核细胞线粒体ROS含量,使用ATP测定试剂盒和BCA蛋白测定试剂盒测定小鼠外周血单个核细胞ATP的含量;使用硫代巴比妥酸法测定丙二醛的含量、二硫代二硝基苯甲酸法测定谷胱甘肽过氧化物酶的活力、羟胺法测定总超氧化物歧化酶的活力。3.无菌解剖小鼠,摘取脾脏并计算脾脏系数,并对小鼠脾脏进行病理学检查;使用TUNEL检测试剂盒检测脾脏细胞的凋亡情况;使用Cell Counting Kit-8试剂盒测定小鼠脾脏中T、B淋巴细胞增殖能力。4.应用同位素标记相对和绝对定量技术分析比较高剂量组和对照组中小鼠的脾脏蛋白质表达差异,利用Gene Ontology和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库对差异蛋白进行生物信息学分析,找出关键差异表达蛋白并应用Wes全自动蛋白定量分析系统和实时荧光定量PCR技术验证差异蛋白及其相应的mRNA表达水平。结果:1.实验期间,没有出现染毒直接导致老鼠死亡的情况发生,但染毒抑制了低、中和高剂量组小鼠的体重增长,高、中和低剂量组小鼠的体重分别从染毒后的第1、2和3周开始显著低于对照组。染毒结束后,低、中和高剂量组小鼠外周血血常规计数均受到明显影响,低、中和高剂量组小鼠的外周血白细胞、淋巴细胞、红细胞和血红蛋白计数显著低于对照组,中、高剂量组小鼠的外周血血小板计数显著低于对照组。2.低、中和高剂量组小鼠的外周血血浆中免疫球蛋白G、白介素-2和白介素-6含量较对照组显著降低。低、中和高剂量组小鼠的外周血单个核细胞的线粒体ROS较对照组显著升高,高剂量组小鼠的外周血单个核细胞的ATP含量较对照组显著降低。中、高剂量组小鼠的外周血血浆丙二醛含量较对照组显著升高,总超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量较对照组显著降低。3.低、中和高剂量组小鼠的脾脏重量较对照组显著降低,中、高剂量组小鼠的脾脏系数较对照组显著降低。染毒使小鼠的脾脏组织出现明显的病理变化,造成组织细胞线粒体、内质网、染色质等损伤,中、高剂量组小鼠受损较为明显。染毒使小鼠的脾脏组织中出现大量的细胞凋亡。中、高剂量组小鼠的脾脏B细胞经脂多糖诱导的增殖能力较对照组显著下降,增殖抑制百分率分别达到了18.38±4.56、36.08±3.04;中、高剂量组小鼠的脾脏T细胞经刀豆蛋白A诱导的增殖能力较对照组显著下降,增殖抑制百分率分别达到了16.13±2.30、29.88±3.06。4.高剂量组和对照组小鼠的脾脏之间共筛选出251个差异蛋白(变化倍数1.5),这些蛋白富集在83条显著差异的GO Terms和5条显著差异的KEGG pathways中。定量分析发现,在mRNA水平上,CD22、NF-κB p65的表达量显著降低,BCL10表达量几乎不变;在蛋白水平上,BCL10表达量显著降低。结论:本文成功构建了苯短期重复染毒小鼠模型,染毒小鼠体重增长受到明显抑制,外周血常规指标明显下降。苯染毒小鼠血浆免疫球蛋白G、白介素-2和白介素-6含量显著降低,表明苯染毒小鼠机体免疫细胞分泌细胞因子的能力显著下降;外周血单个核细胞线粒体ROS产生显著增加,ATP含量显著降低表明了苯染毒小鼠外周血单个核细胞线粒体功能出现显著异常;血浆氧化/抗氧化水平的测定结果显示苯染毒导致小鼠外周血出现了显著的氧化应激。以上结果提示苯染毒导致小鼠外周血氧化应激,诱导了外周血单个核细胞线粒体功能的下降,导致其功能受损。此外,苯染毒还造成小鼠脾脏组织病理学改变,组织细胞大量凋亡,淋巴细胞增殖能力受到抑制;BCR及NF-κB信号通路中的CD22、BCL10和NF-κB p65可能是苯诱导小鼠脾脏免疫功能受损的关键调控分子。总之,苯染毒对小鼠的外周血单个核细胞及脾脏免疫功能造成影响,实验结果为进一步探究苯的免疫毒性效应及其作用机制奠定了一定的理论基础。
【图文】：

环境空气污染,结构简式,人类活动,结构式

相对分子质量为 78，结构式和结构简式如图1 所示。常温下是一种透明，无色的液体，在空气中易挥发，微溶于水，易溶于丙酮、氯仿、乙醇和四氯化碳等有机溶剂。图 1 苯的结构式和结构简式苯是一种有毒的环境空气污染物，主要来源于人类活动，特别是煤、木材和石油等燃烧过程中有大量苯产生[1]。另外，汽油、汽车尾气、工业废气和香烟烟雾中含有大量的苯[1]。过去，苯通常被用作油墨的成分、有机材料的溶剂、制备化学和药物用品的原料以及无铅汽油的添加剂等；现在，苯主要用于制造苯乙烯、苯酚、异丙苯、环己烷、苯胺、马来酸酐、烷基苯和氯苯等有机化学品，，同时它是生产蒽醌、对苯二酚、烷基苯、六氯化苯、苯磺酸和其他用于生产药物、染料、杀虫剂和塑料产品的中间体[1, 2]。由于苯广泛用于制造工农业和日常生活用品，导致其接触人数位于常见接触化学毒品首位，对人类生产生活的安全性构成极大的威胁[2]。人群接触苯的途径主要分为两大类：职业暴露和非职业暴露。对于非职业暴露，接触苯的主要来源是呼吸含有烟草烟雾、受过苯污染的空气（例如，交通繁忙的地区、汽油加油站周围、新装修的房屋内等），饮用受过苯污染的水或食用受过苯污染的食物等[3]。近些年，随着人们生活水平的不断提高，大多数家庭都会精心甚至过度装修房屋，由此引发的以苯等挥发性有机物超标造成的室内环境污染问题受到了广泛关注，更有学者认为，诸如这类“室内环境污染”是继“煤烟污染”和“光化学污染”之后，人类正在面临的第三次全球性的空气污染问题[4]。在我国

周期,玉米油,小鼠,灌胃

军事科学院硕士学位论文实验方法实验动物处理验小鼠饲养于 SPF 级实验动物房，控制饲养环境为温度 23±2℃70%、光照强度 200Lux 并且按照 12h/12h 进行昼夜交替，实验食饮水，每隔 2 天更换新鲜的饲料、饮用水和垫料。在苯染毒鼠先置于 SPF 级动物房适应性饲养 1 周，随后按照随机性的个组：对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。每组均为 10分为两笼饲养，每笼5只。低、中和高剂量组的染毒剂量分别为g 和 500mg/kg，以玉米油为溶剂配制苯溶液，采用灌胃的方式进给予玉米油，灌胃容量按照 5ml/kg 计算。如图 1.1，每天上午周 5 天，连续 4 周，每周一及处理小鼠之前称取小鼠体重并记夜禁食，第 2 天上午 8:30 处死小鼠，提取生物样品用于后续
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R99

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