Caspase-1，IL-1β和IL-18调控在云芝糖肽（PSP）诱导的Molt-4细胞死亡机制中的作用研究

发布时间：2020-05-25 01:31

【摘要】：云芝糖肽(PSP)是从云芝发酵菌丝体中提取的结合蛋白多糖,临床上用于增强肿瘤病人的免疫功能。近年发现它还能直接通过干扰细胞周期、诱导凋亡等机制抑制、杀伤多种癌细胞。本实验室前期研究发现PSP诱导Molt-4等白血病细胞死亡过程中形态除发生典型凋亡样固缩改变外,还有体积膨大现象,提示可能有其它死亡机制存在,因此本研究进一步进行了探讨。研究用显微测量术测量了PSP引起的Molt-4细胞直径变化。结果显示,20、40、80μg/mL PSP可分别使细胞平均直径从正常的10.80±1.40μm增加到12.12±2.06、13.01±2.63和13.81±2.52μm(P0.01)。流式细胞术前散射信号分析发现细胞大小有增加和缩小两种不同的变化。细胞与PSP(20、40、80μg/mL)分别孵育48h后用caspase-1荧光抑制剂FLICA标记,再用流式细胞术分析FLICA阳性细胞比率,发现由对照组的2.38%分别增加到4.57、5.25、16.40%(P0.05)。用PSP作用12、24、36、48h后再同样检测,发现FLICA阳性细胞比率从对照组的3.2%分别增加到8.65、12.4、18.6和22.8%(P0.001)。这些结果提示PSP可浓度和时间依赖性激活Molt-4细胞中的caspase-1。VX-765、Ac-YVAD-CMK等caspase-1抑制剂在25-100μM浓度范围内不但不能抑制PSP诱导的caspase-1激活及细胞死亡,还显示出明显的细胞毒性。采用流式细胞分析法,用Gating技术分析FLICA阳性细胞(FLICA+)在前散射(FS)/侧散射(SS)信号散点图上的分布,发现FS信号强(体积较大)的细胞百分率随PSP(80μg/mL)作用时间延长,由对照组的4.71%分别增加到29.8%(12h)、34.7%(24h)、46.2%(36h)、30.0%(P0.01)(48h)。FS信号弱的较小的细胞百分率虽然也有增加(9.51、13.3、17.1、24.4%,P0.001),但显微镜观察发现细胞出现空泡,有FLICA标记的胞质边缘化推断由此变化造成FS信号减弱,而非体积变化所致。细胞用FLICA、7-AAD和Annexin V-APC三种试剂同时进行标记,流式细胞检测,Gating选取7-AAD阴性的完整细胞,发现随PSP浓度和作用时间的增加,细胞出现Annexin V阳性、FLICA阴性(Ann+/FLICA-)的细胞和FLICA阳性、Annexin V阴性(Ann-/FLICA+)的细胞及Ann+/FLICA+的细胞三种不同变化,提示有部分细胞(Ann+/FLICA-)发生早期凋亡,部分细胞发生caspase-1相关的死亡(Ann-/FLICA+),且这种死亡机制与凋亡有关(Ann+/FLICA+)。时序研究发现Ann-/FLICA+的细胞先出现在前,Ann+/FLICA+的细胞出现在后,提示caspase-1相关的细胞死亡机制可转为凋亡。流式细胞术进一步分析发现,Ann-/FLICA+的细胞FS信号强,细胞具有较大的体积,而Ann+/FLICA+的细胞FS信号弱,也提示细胞体积增大和caspase-1激活是细胞死亡过程中早期的事件。caspase-1参与的细胞死亡过程通常伴随IL-1β和IL-18的产生,因此用实时定量PCR方法分析了PSP诱导的Molt-4中IL-1β和IL-18基因表达水平。以GADPH基因为内参,发现20,40,80μg/mL PSP可浓度及时间依赖地上调IL-1β和IL-18基因表达。IL-1β最高被上调2.9倍(80μg/mL,12h),IL-18上升了14.5倍(80μg/mL,24h)。采用DCFH-DA试剂标记细胞内的活性氧簇(ROS)产生,发现20、40、80μg/mL PSP可使ROS阳性细胞相对荧光强度上调1.2、2.7、3.2倍。综上所述,PSP除能诱导凋亡外,还可使细胞体积发生膨大、激活caspase-1、上调IL-1β、IL-18基因的表达。这种机制可能为焦亡。
【图文】：

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白组分析的方法对 THP-1 细胞裂解液进行分析，发现了 82 种 caspase-1 可能的物[42]。caspase-1 底物的不同诱导的下游反应则不同。 Xinmao 等[43]人则发现spase-1 参与了蜱唾液腺的凋亡，当 RNA 干扰抑制后，唾液腺细胞凋亡延迟。的唾液腺中似乎存在另一种细胞死亡形式，这种现象可能是由涉及自噬相关基 4D 的代偿性自噬引起的。在小鼠失血性休克模型的肝细胞中，活化 caspase-1于通过激活线粒体自噬阻止肝细胞凋亡至关重要。休克和复苏过程中 caspase-1激活增加了 beclin-1 的表达，beclin-1 是一种重要的自噬启动蛋白，可清除受的线粒体以减少过量 ROS 的产生[44]。caspase-1 在程序性细胞死亡中发挥了重要的调控作用，caspase-1 的失调与种疾病密切相关。肿瘤细胞中 caspase-1 表达较低，caspase-1 过表达可以抑制瘤细胞生长[45, 46]。caspase-1 缺乏的小鼠肿瘤形成明显增强，早期结肠上皮细增殖增加，晚期细胞凋亡减少。卵巢癌和前列腺癌细胞中也有相同现象，暗示靶向 caspase-1 可能是肿瘤治疗的一个新方向[47, 48]。

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上海师范大学硕士学位论文2.2 实验结果2.2.1 PSP 对 Molt-4 细胞增殖的影响采用光学显微镜观察不同浓度 PSP 组分与 Molt-4 细胞共孵育 48 小时细胞群生长情况。随着 PSP 组分浓度增加，细胞群分散，，细胞数目减少（图 2.1）。80μg/mLPSP 处理 Molt-4 细胞的时效关系研究中也有相同趋势（图 2.2）。2.1.4.5 统计学方法：统计学软件为 GraphPad Prism 5. 0进行实验数据统计,数据以均数±标准差表示，组间差异用单因素方差检验统计分析，两组间比较用t检验，以P<0. 05 定为差异有统计学意义。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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