纳米炭黑颗粒和铅离子联合诱导NR8383肺泡巨噬细胞凋亡的作用和机制研究

发布时间：2020-05-25 07:05

【摘要】：背景:空气中的颗粒物(Particulate matter,PM)是大气污染影响人类健康的主要成分,其毒性已被大量研究证实。其中粒径较小的超细颗粒更容易在肺中聚集沉积,对人类健康的影响严重。超细颗粒的表面积与体积比大,具有强大的吸附能力,可吸附大量有毒污染物,共同造成人体细胞和器官损伤。但是,二者可能产生的交互作用及介导其联合作用的机制尚不清楚。因此,本研究旨在探究一种典型的大气超细颗粒物纳米炭黑颗粒(Carbon black nanoparticles,CBNPs)和一种具有代表性的空气污染物铅离子(Pb~(2+))的联合作用和机制。CBNPs是研究空气颗粒物毒性的良好模型,空气中的CBNPs主要来自于燃烧源不完全燃烧产生的烟灰。由于其粒径较小,可深入至肺泡,直接影响肺功能。Pb~(2+)作为一种典型的空气污染物,来源于人为活动,如燃料燃烧,工业生产和垃圾焚烧排放等。二者经呼吸道进入肺内,可在肺部沉积,导致肺部疾病。肺泡巨噬细胞位于肺泡腔及微小气道内,是肺组织内重要的常驻细胞和防御细胞,在肺部疾病的发病过程中,巨噬细胞受损是常见的重要机制。先前的研究发现CBNPs或Pb~(2+)可诱导肺泡巨噬细胞损伤和凋亡,但目前尚无联合CBNPs和Pb~(2+)应用对大鼠肺泡巨噬细胞的作用及机制的研究报道。目的:本实验主要研究CBNPs和Pb~(2+)联合诱导NR8383细胞凋亡的作用和可能的机理,旨揭示CBNPs和Pb~(2+)联合促细胞凋亡作用机制,为预防和治疗PM相关肺疾病提供理论依据。方法:1.吸附铅离子的纳米炭黑颗粒(CBNPs-Pb~(2+))制备及表征:采用DLS,TEM,SEM以及多点BET分析,对CBNPs及CBNPs-Pb~(2+)进行表征,使用ICP-OES量化CBNPs对Pb~(2+)的吸附情况,评估吸附颗粒的稳定性。2.CBNPs和Pb~(2+)联合促凋亡作用研究:将大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)分别或共同暴露于一定浓度的CBNPs和Pb~(2+)中24h,分析各种细胞参数。Annexin V-FITC/PI染色,DAPI染色以及Western blot检测细胞凋亡水平,采用DCFDA检测活性氧(ROS)产生,JC-1用于检测线粒体膜电位的变化。3.联合作用机制研究:采用透射电子显微镜,Western blot,mRFP-GFP-LC3腺病毒检测细胞自噬水平以及自噬流,采用自噬诱导剂雷帕霉素和自噬溶酶体途径抑制剂氯喹进一步分析自噬溶酶体途径在CBNPs-Pb~(2+)诱导NR8383细胞凋亡中的作用。结果:1.成功制备了吸附铅离子的纳米炭黑颗粒(CBNPs-Pb~(2+)),通过对粒子表征分析发现,CBNPs可以稳定吸附Pb~(2+),且吸附Pb~(2+)之后,其物理性质发生改变。动态光散射结果显示,吸附后的纳米颗粒形成的团簇平均粒径减小,并能在超声处理后一段时间内保持分散状态,这使其更容易被细胞吞噬,透射电子显微镜证实了这一现象;2.CBNPs-Pb~(2+)显著增加NR8383细胞凋亡水平;3.CBNPs-Pb~(2+)显著增加NR8383细胞中ROS的量,降低NR8383细胞的线粒体膜电位,导致线粒体功能障碍,最终导致细胞凋亡;4.CBNPs-Pb~(2+)激活NR8383细胞凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 9,增加促凋亡蛋白Bax表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达,显著降低Bcl-2/Bax比值;5.CBNPs-Pb~(2+)阻断NR8383细胞自噬流,导致细胞内自噬体累积和细胞溶酶体功能障碍;6.自噬溶酶体途径抑制剂氯喹进一步加重CBNPs-Pb~(2+)所抑制的细胞自噬流,促进细胞凋亡,而自噬诱导剂雷帕霉素则能逆转上述作用。结论:在这项研究中,我们使用CBNPs和Pb~(2+)为模型材料研究其对NR8383肺泡巨噬细胞的联合毒性作用及机制。本研究发现,CBNPs可以均匀且稳定地吸附Pb~(2+),吸附后的纳米颗粒物理性质发生改变;CBNPs-Pb~(2+)诱导细胞过度氧化应激及线粒体损伤,通过导致NR8383细胞溶酶体功能障碍和阻断细胞自噬流,显著增强细胞凋亡水平;CBNPs-Pb~(2+)可以通过自噬溶酶体途径诱导细胞凋亡。我们的研究结果为理解环境微粒的毒性作用和致肺疾病的病理机制提供了新的见解,还可能为预防和治疗空气污染相关肺疾病提供实验基础。
【图文】：

元素分析,粒子,元素

原生粒径为 25nm，BET 比表面积为 100m2/g。由于纳米粒子的物理性质可影响其生物学及毒理学反应，因此这些性质的表征在其毒性评估中是很重要的[100]。在本部分研究中，我们采用 ICP-OES、DLS、TEM、SEM 以及多点 BET 分析，量化了 CBNPs 对 Pb2+的吸附并分别对 CBNPs 和 CBNPs-Pb2+进行了表征。3.1.1 CBNPs 对 Pb2+的吸附情况按照上述方法制备 CBNPs-Pb2+后，使用能谱仪对粒子进行元素定性分析，可发现CBNPs除去基本成分C元素外，，还存在少量的S元素与O元素。对CBNPs及 CBNPs-Pb2+分别进行 mapping 分析，确定元素的面分布和线分布，可以较直观地观察到 Pb 元素均匀分散在粒子表面，说明铅离子可以稳定且均匀吸附于CBNPs。此结果能初步证实金属铅离子稳定吸附于 CBNPs 上，所构建纳米粒子吸附金属离子模型可以用于后续实验。如图 3.1 所示。

电镜图,电镜,动态光散射,ζ电位

图 3.2 CBNPs 及 CBNPs-Pb2+的电镜图CBNPs 和 CBNPs-Pb2+的透射电镜图像；（c，d） CBNPs 和比例尺为 500nm动态光散射测量 DMEM-F12 中 CBNP，CBNPs-Pb2+的径和ζ电位le Hydrodynamic size(nm) zeta-potentis 671.2±9.96 -30.5±3.b2+452.6±22 -34.8±0.7
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R99

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