CRM1抑制剂的设计优化及抗淋巴瘤机制研究

发布时间：2020-05-27 14:41

【摘要】：淋巴瘤是一类起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤,是淋巴组织内原有的淋巴细胞或组织细胞发生恶性增生的结果,淋巴瘤约占全球肿瘤的3-4%。随着多年来对其机制的研究,现在认为淋巴瘤的发病原因多与人体的免疫系统相关,但其发病机制尚不明确。CRM1是细胞内重要的核转运蛋白之一,其负责转运的蛋白大约有285个,且这些货物蛋白多与肿瘤的发生密切相关,如抑癌因子survivin、p53、p27κIP1、APC等。研究显示CRM1的表达量与多种类型淋巴瘤的发生密切相关,且CRM1高表达的患者预后较差。天然产物为小分子药物的发现提供了丰富的来源,其结构多样性,化学性质多样性,生物相容性等特征为药物筛选提供了非常好的基础。因此,从自然界中发现能够靶向抑制CRM1的天然小分子,阐明其作用机制,并以此为基础,对小分子进行优化和设计,得到靶向性更强,毒副作用更低的CRM1抑制剂,能为CRM1高表达的淋巴瘤的治疗提供新的治疗方案。本论文主要针对以上问题做了如下几个方面的研究。第一,CRM1蛋白可能为莱菔素(LFS-01)在体内发挥生物学功能的一个重要靶点。本研究首先通过细胞活性检测的方法验证了 LFS-01抑制淋巴瘤细胞增殖的作用,并且发现LFS-01对正常人外周血单核细胞PBMC的增殖基本无影响。通过靶点验证试验及MALDI-TOF质谱试验验证了 LFS-01能够和CRM1发生共价结合,且结合位点为Cys528。通过激光共聚焦检测方法,发现LFS-01能抑制CRM1介导的RanBP1和p53的细胞核输出。通过构建CRM1突变细胞株,证明CRM1是LFS-01在细胞内的主要靶点之一。通过Western blot方法检测,发现LFS-01能够降低细胞内CRM1的蛋白水平。借助流式细胞术,检测到LFS-01能够将淋巴瘤细胞周期抑制在G2-M期,并且能够激活内源性凋亡通路,诱导淋巴瘤细胞凋亡。第二,通过LDH实验、电镜检测、Western blot及激光共聚焦等试验手段,发现LFS-01能够引起淋巴瘤细胞发生自噬。通过检测线粒体和自噬小体及线粒体和溶酶体的共定位,发现LFS-01诱导的自噬属于线粒体自噬。进一步研究发现,LFS-01诱导线粒体自噬发生的两个主要因素分别为AMPK-mTOR通路的激活和p62蛋白表达量的上调。其中,p62表达量上调的主要原因是CRM1被抑制后Nrf2的细胞核输出受阻,从而增加p62基因的转录。通过建立小鼠模型,发现LFS-01能够通过诱导细胞凋亡和细胞自噬来抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长。第三,通过计算机辅助的药物设计,借助Discovery Studio工具,以CRM1和LFS-01的结合构象为基础,进行了基于受体结构的药物生长,得到一系列能够靶向CRM1的小分子。通过虚拟筛选结合经验分析,合成了4个代表性小分子。通过抗肿瘤活性检测,发现LFS-25的活性最好。与LFS-01相比,LFS-25的活性提高了 50倍。通过分子动力学模拟和MM-PBSA能量分解分析,发现LFS-25靶向性增强的原因可能是与NES 口袋中的氨基酸残基有更强的范德华力△Evdw和静电相互作用△Eele。通过对内源性货物蛋白RanBP1和p53的出核抑制检测及对外源性NES-GFP蛋白和Foxo1-GFP蛋白的出核抑制检测,证实了 LFS-25对CRM1的靶向抑制活性。并且发现Cys528是LFS-25靶向作用于CRM1的重要氨基酸。在弥漫性大B细胞淋巴瘤中,通过激光共聚焦和Western blot手段,观察到IκBα在细胞核内的聚集。通过免疫共沉淀技术,检测到随着药物浓度的增加,滞留在细胞核内的IκBα和NF-κB的相互作用增强。通过双荧光素酶报告基因检测技术,观察到NF-κB的转录活性被LFS-25抑制。最后,通过流式细胞术发现LFS-25能够将细胞周期抑制在G1期,同时激活细胞凋亡信号通路,诱导细胞发生凋亡。本论文通过多种实验检测手段阐明了莱菔素靶向作用CRM1和抑制淋巴瘤细胞增殖的作用机制,并以莱菔素为先导化合物,设计了具有更强靶向性和抗淋巴瘤作用的小分子药物LFS-25,并且对LFS-25杀伤大B细胞淋巴瘤的机制做了初步探讨。
【图文】：

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【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914;R96

【参考文献】

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本文编号：2683684