mTOR信号分子在纳米氧化铝致斑马鱼幼鱼早期神经行为损伤中的作用

发布时间：2020-05-27 16:06

【摘要】：目的:通过暴露纳米氧化铝建立斑马鱼幼鱼早期神经行为损伤模型,探讨m TOR信号分子在其中所起的作用及可能机制。方法:将受精后6h(6hpf)的斑马鱼胚胎随机分成6组,染毒6天:空白对照组(E3培养液)、纳米氧化铝组(12.5、25、50、100、200μg/m L)。采用六孔板染毒,每组160颗卵,共8个孔,20颗卵/10m L试液/孔,染毒液更新周期为1天。染毒结束后,通过斑马鱼幼鱼行为轨迹跟踪系统检测各组幼鱼的早期神经行为,包括黑暗状态下的运动行为及趋触性检测、对强光刺激的惊恐逃避反射试验;采用ICP-MS检测各组幼鱼脑部的铝含量。采用RT-PCR法检测各组幼鱼脑部m TOR信号通路相关基因的表达;采用全组织包埋免疫组化法检测各组幼鱼脑部m TOR蛋白的表达;采用显微注射法特异性敲低m TOR基因的表达,观察斑马鱼幼鱼早期神经行为的改变。结果:1.斑马鱼幼鱼行为学结果:与溶剂对照组相比,25μg/m L纳米氧化铝组幼鱼的运动速度、运动距离均显著上升(P0.05),之后随染毒浓度的增加,又出现下降的趋势;200μg/m L纳米氧化铝组幼鱼趋触性程度较溶剂对照组显著下降(P0.05);100μg/m L和200μg/m L纳米氧化铝组对强光刺激的惊恐反射和强光刺激后的黑暗逃避反射能力均下降(P0.05)。2.幼鱼脑部铝含量检测结果:纳米氧化铝组染毒24h后的胚胎和染毒48h后的幼鱼脑部深染,以100μg/m L组最为明显;与溶剂对照组相比,100μg/m L纳米氧化铝组幼鱼脑部的铝含量显著增加(P0.05)。3.RT-PCR结果:50、100和200μg/m L纳米氧化铝组斑马鱼幼鱼脑部m TOR的表达量明显低于对照组(P0.05);25、50μg/m L纳米氧化铝组斑马鱼幼鱼脑部AKT3的表达量明显低于对照组(P0.05)。PIK3Ca、PIK3R1、AKT1、AKT2、AMPK、TSC1、TSC2基因的表达量各组间均无明显差异(P0.05)。50、100和200μg/m L纳米氧化铝组斑马鱼幼鱼脑部ULK1的表达量明显高于对照组(P0.05);100、200μg/m L纳米氧化铝组斑马鱼幼鱼脑部ULK2的表达量明显高于对照组(P0.05);200μg/m L纳米氧化铝组斑马鱼幼鱼脑部Beclin1的表达量明显高于对照组(P0.05)。Cyt C、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ基因的表达量各组间均无明显差异(P0.05)。4.全组织包埋免疫组化结果:与溶剂对照组相比,50、100、200μg/m L纳米氧化铝组幼鱼脑部荧光信号降低,提示m TOR蛋白表达下调。5.显微注射结果:显微注射m TOR Morpholino组幼鱼的运动速度和运动距离与对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);而显微注射组幼鱼的趋触性程度与对照组相比显著下降(P0.05);与对照组相比,显微注射组幼鱼对强光刺激的惊恐反射能力下降(P0.05);且幼鱼脑部m TOR基因的表达降低(P0.05)。结论:1.纳米氧化铝主要抑制了幼鱼早期的趋触性行为和对强光刺激的惊恐逃避反射,对运动行为表现为低剂量兴奋、高剂量抑制的效应。2.纳米氧化铝可在斑马鱼幼鱼脑部蓄积,且蓄积量随着染毒浓度的增加而增加。3.纳米氧化铝可下调幼鱼脑部m TOR蛋白和基因的表达,同时使自噬相关基因ULK1、ULK2、Beclin1表达量增加。4.特异性敲减m TOR基因可抑制斑马鱼幼鱼早期的神经行为。
【图文】：

一次卵裂；受精后 2.5~3h 为囊胚初期，此时可以开始染毒实验（ 已发育成一条未破膜的幼鱼，身体时而卷曲（见图 C）；受精出，此时的幼鱼身体色素沉着较少，，通体透明，脑组织清晰可见受精后 6 天的幼鱼已初具成鱼的形态，脑组织进一步发育（见幼鱼就可以开始喂食。胚胎从受精卵发育至受精后 6 天的幼鱼重要阶段[21]，在此阶段对幼鱼的染毒处理影响因素单一、数量足实验结果稳定，是神经行为发育研究的良好模型。为是各项神经功能的整合[22]，包括运动能力、神经反射、感觉能统的发育是其物质基础。斑马鱼幼鱼在早期阶段就可以表现出暗状态下的运动行为、趋触性行为和对强光刺激的惊恐逃避反出的幼鱼就具有运动行为，主要检测指标为运动速度和运动距鱼开始表现出趋触性行为和对强光刺激的惊恐逃避反射，趋触紧张程度有关，而对强光刺激的惊恐逃避反射是幼鱼先天具有的

山西医科大学硕士学位论文周期控制在 14h/l0h。以卵凝结或心脏停跳为死亡终点，记录受精后 ；分别记录胚胎受精后 48、54、60、72、96h 的孵化率。黑暗状态下的运动行为及趋触性检测: 在显微镜下随机选择各浓度组外pf（day post-fertilization）幼鱼，将其放入 24 孔板中，24 条/组。开启为轨迹跟踪系统，参考文献[27]设置观察区域和检测程序。将每个观察区等的两个区：内区（inner area）和外区（outer area），如图 2 示。采动视频。用 EthoVision XT 10 软件分析视频，导出运动速度、运动距计持续时间百分数等参数。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99

【参考文献】

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本文编号：2683786