冬凌草甲素类似物OP16联合雷帕霉素在食管鳞癌中的药效学及机制研究

发布时间：2020-05-27 18:00

【摘要】：目的1.探讨OP16与雷帕霉素在体外联用时,对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、自噬的影响及其分子机制。2.探讨OP16与雷帕霉素在体内联用时,对食管鳞癌裸鼠移植瘤生长、凋亡的影响及其分子机制,同时对药物的潜在毒性进行初步评价。方法1.通过克隆形成实验、CCK-8法检测食管鳞癌细胞中OP16与雷帕霉素联用时的抗增殖活性,同时通过Western blot检测m TORC2/Akt(Ser473)和PI3K/Akt(Thr308)通路相关蛋白的表达。2.通过Annexin V-FITC/PI染色法检测食管鳞癌细胞中OP16单用或与雷帕霉素联用时的促凋亡活性,同时通过Western blot检测线粒体凋亡通路相关蛋白的表达。3.通过Western blot、免疫荧光法检测OP16对食管鳞癌细胞中LC3和SQSTM1/p62表达和分布的影响,接着通过Western blot、m RFP-GFP-LC3腺病毒实验、透射电子显微镜检测OP16对食管鳞癌细胞中自噬过程的影响,然后通过PI染色法、CCK-8法探讨OP16诱导的自噬和凋亡之间的关系,最后通过Western blot探讨OP16诱导自噬的分子机制。4.通过建立食管鳞癌裸鼠移植瘤模型,检测OP16与雷帕霉素联用时对肿瘤生长的抑制作用,通过HE染色法、TUNEL法检测对细胞体内凋亡的诱导作用,通过Western blot检测裸鼠移植瘤中m TORC2/Akt(Ser473)、PI3K/Akt(Thr308)及线粒体凋亡通路相关蛋白的表达,并通过对裸鼠死亡率、体重变化、血常规参数、脏器系数及肝肾HE染色的检测对药物潜在毒性进行初步评价。结果1.食管鳞癌细胞中,OP16与雷帕霉素联用可协同抑制克隆形成;OP16与RAD001联用可协同抑制细胞增殖;OP16单用能抑制p-Akt、PI3K p85α、PI3K p110α的表达,并促进p-Rictor的表达;OP16与雷帕霉素联用可抑制雷帕霉素引起的p-Akt、PI3K p85α、PI3K p110α表达升高,并逆转雷帕霉素引起的p-Rictor表达降低。2.食管鳞癌细胞中,OP16单用可促进细胞凋亡;OP16与雷帕霉素联用可协同促进细胞凋亡;OP16单用能抑制Bcl-2的表达,并促进Bax、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达;OP16与雷帕霉素联用时可协同抑制Bcl-2的表达,并协同促进Bax、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达。3.食管鳞癌细胞中,OP16可以促进LC3的表达和胞内聚集,并抑制SQSTM1/p62的表达;OP16可促进自噬体形成从而激活自噬流;通过Z-VAD-FMK抑制凋亡不能减少OP16引起的细胞死亡;通过饥饿处理激活自噬能显著增加OP16引起的细胞死亡;通过Chloroquine处理或下调Beclin-1表达抑制自噬,均能显著减少OP16引起的细胞死亡;OP16不影响Atg5、Atg7和Atg12的表达;通过SC79升高Akt磷酸化能显著降低OP16诱导的LC3-II表达。4.食管鳞癌裸鼠移植瘤模型中,OP16与雷帕霉素联用可协同抑制肿瘤生长,并协同诱导细胞的体内凋亡;OP16与雷帕霉素联用对裸鼠移植瘤中相关蛋白表达的影响与体外结果一致;OP16与雷帕霉素联用对裸鼠的死亡率、体重变化、血常规参数、脏器系数均无明显影响,且没有明显的肝肾毒性出现。结论1.OP16与雷帕霉素在体外联用时可协同调控食管鳞癌细胞的增殖、凋亡、自噬,其分子机制与OP16和雷帕霉素对m TORC2/Akt(Ser473)、PI3K/Akt(Thr308)和线粒体凋亡通路的调控作用有关。2.OP16与雷帕霉素在体内联用时可协同调控食管鳞癌裸鼠移植瘤的生长和凋亡,其分子机制与体外实验一致。在治疗剂量下两药联用时,裸鼠体内无明显不良反应或药物毒性反应出现。
【图文】：

冬凌草,冬凌草甲素

喉肿痛、扁桃腺炎等症，且其对多种肿瘤均有一定疗效，尤其是对消化道肿效果可与紫杉醇相较[20]。近年来更有临床研究证明，冬凌草单用或与化疗药用可显著增加食管癌患者生存率，展现出了较好的治疗效果[19,21]。在众多抗中药中，冬凌草具有良好抗肿瘤活性和低毒性的特点，且其作为一种野生植我国的资源非常丰富，逐渐引起了众多医药研究者的关注[22-23]。冬凌草中的化学成分主要包括二萜、三萜、甾体、黄酮、生物碱以及氨基化合物[24-25]，其中二萜类化合物冬凌草甲素（oridonin）是其主要的抗肿瘤分子之一[26-27]。已有大量机制研究证明，冬凌草甲素能靶向肿瘤细胞的增期、凋亡和自噬等通路，因而具有一定的抗肿瘤活性[28-30]。然而由于冬凌草水溶性较差、抗肿瘤活性较一线药物相对较弱、化学结构不稳定等原因，限其在临床上的应用[31-32]。因此，，当下的研究重点应立足于从冬凌草中提取新性分子，并对其结构进行修饰改造以改善其抗肿瘤活性和化学结构稳定性，对其药理作用机制进行深入研究，从而开发出来源于冬凌草的高效抗肿瘤，改善癌症患者特别是食管癌患者的治疗现状。

负反馈,抑制剂,活性能,研究者

5图 1.2 p70S6K 介导的负反馈通路由于上述原因，越来越多的研究者认为在使用 mTORC1 抑制剂的同时抑制PI3K 或者 mTORC2 的活性能有效抑制 mTORC1 抑制剂引起的 Akt 负反馈激活可能具有更为理想的肿瘤抑制作用[37,59,68-69,77]，因而推动了 PI3K/mTOR 双重抑制剂和 mTORC1/mTORC2 双重抑制剂的产生[82]。然而后续的临床前和临床研究中发现，mTORC1/mTORC2 双重抑制剂依然不能有效的削弱 Akt 的负反馈激活效应[83]；而 PI3K/mTOR 双重抑制剂对该通路具有彻底抑制作用，因而在临床应用中具有很大的药物毒性，治疗窗较窄[59,83]。这些原因导致了该两种新型 mTO抑制剂的临床应用极大受限，负反馈通路这一问题依然没有得到有效解决。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

【参考文献】