透明质酸修饰酸敏感共传递纳米递送系统在类风湿性关节炎中的研究

发布时间：2020-05-29 09:45

【摘要】：类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病,主要表现为关节疼痛、肿胀和僵直,严重影响了病人的生活质量。髓系细胞白血病-1基因(MCL-1)siRNA可以通过抑制巨噬细胞中MCL-1的表达引起巨噬细胞的凋亡,进而抑制RA的进程,且其毒性较小,但是MCL-1 siRNA不能及时的缓解RA患者的炎症和疼痛。地塞米松(Dex)是一种经典的治疗RA的药物,能够快速的缓解RA患者的疼痛和炎症,但是由于Dex需要长期高剂量的给药,常常带来全身毒副作用。因此我们推测MCL-1 siRNA和Dex联合用药能够在增加疗效的同时减少全身毒副作用。在RA发病部位会有大量巨噬细胞聚集,这些巨噬细胞可以通过分泌促炎细胞因子加剧RA的进程,因此,抑制RA发病部位的巨噬细胞是治疗RA的一个关键。RA发病部位的巨噬细胞活化后其表面会过量表达CD44,CD44能与透明质酸(HA)特异性结合,因此HA可以作为治疗RA的靶向配体。在细胞中,溶酶体的pH值为4.5-5.0,早期核内体的pH值为5.0-6.0,晚期核内体的pH值为4.5-5.0,而胞浆中的pH值则为7.4。针对这种特点,我们设计了酸敏感的纳米载体。聚缩酮是一类新型的酸敏感聚合物,其在酸性环境中可以快速降解成中性小分子,因而可以作为RA发病部位药物传递的优良载体。因此,本文拟设计一种以聚缩酮为核心,HA靶向的酸敏感纳米载体,共传递MCL-1 siRNA和Dex治疗RA。本文分别以两种聚缩酮(PCADK和PK3)为纳米载体核心,外部连接HA作为靶向基团,包载Dex、siRNA或者两者药物组合。通过建立类风湿性关节炎大鼠模型,考察纳米载体对RA大鼠的作用。本研究一共分为以下三个部分:1.HA靶向的Dex酸敏感纳米载体(HAPNPs/Dex)的制备与评价本部分研究以PCADK为纳米载体核心,添加聚乙烯亚胺(PEI)与蛋黄卵磷脂(egg PC),用HA修饰纳米载体。以PEI加入量、egg PC加入量、HA加入量作为处方优化的条件,优选得到的纳米载体配方为PCADK 20 mg,PEI 1 mg,egg PC 8 mg,0.1%HA 500μL。通过纳米粒度电位仪测定HAPNPs/Dex的粒径为150.5±2.47 nm,zeta电位为-2.84±0.53 mV,HAPNPs/Dex的实际载药量为7.26±0.71%。细胞摄取以及细胞毒实验表明HAPNPs/Dex能够特异性的靶向到活化的巨噬细胞并杀伤巨噬细胞,而对非活化的巨噬细胞增殖没有显著影响。体外释放结果表明在酸性条件下HAPNPs/Dex中Dex的释放速率明显快于在中性条件下,说明HAPNPs/Dex具有酸敏感特性。在动物体内药效实验中,HAPNPs/Dex能有效的减少炎症细胞,减轻软骨破坏,减少促炎细胞因子的表达进而抑制RA的进程。2.载MCL-1 siRNA的酸敏感纳米载体(HAPKPNPs/siRNA)的制备与评价本实验首先建立了MCL-1 siRNA的体外分析方法,通过Cy5标记MCL-1siRNA(Cy5-siRNA),并用荧光分光光度计建立Cy5-siRNA的标准曲线,结果表明Cy5-siRNA的荧光强度与浓度线性关系良好。随后将氢化大豆卵磷脂(DOTAP)与MCL-1 siRNA连接形成稳定复合物(DOTAP-siRNA),并以酸敏感特性更强的PK3作为纳米载体核心,对egg PC的加入量,DOTAP-siRNA的量和HA的加入量进行处方优化,得到最优处方为PK3 20 mg,egg PC 6 mg,DOTAP-siRNA 1.5 nM,0.1%HA 200μL。测定HAPKPNPs/siRNA的粒径为115.56±5.44 nm,zeta电位为11.38±0.98 mV,载药量为5.43±0.003%,包封率为95.09±0.05%。细胞毒实验表明HAPKPNPs/siRNA能够促进活化的巨噬细胞凋亡。体外释放实验表明HAPKPNPs/siRNA在酸性环境释放速率更快,说明HAPKPNPs/siRNA具有酸敏感特性。RA大鼠模型体内药效结果表明,HAPKPNPs/siRNA能够减少部分炎症细胞,抑制部分促炎细胞因子的表达进而抑制RA的进程。3.共传递MCL-1 siRNA与Dex的透明质酸靶向酸敏感纳米载体(HAPKNPs/(Dex+siRNA))的制备与评价通过第2部分的方法制备HAPKNPs/(Dex+siRNA),测定其粒径为117.07±2.21 nm,zeta电位为15.53±1.06 mV,其中MCL-1 siRNA的载药量为4.34±0.026%,包封率为93.33±5.51%,Dex载药量为5.03±0.13%,包封率为40.55±2.32%。体外释放结果表明HAPKNPs/(Dex+siRNA)具有酸敏感特性。细胞毒实验表明HAPKNPs/(Dex+siRNA)对活化的巨噬细胞杀伤效果强于两种单载的纳米载体。动物体内药效实验结果表明两种单载的纳米载体对RA的抑制作用明显弱于HAPKNPs/(Dex+siRNA)。由于联合用药有一定的风险,我们考察了HAPKNPs/(Dex+siRNA)的安全性,在细胞实验中,HAPKNPs/(Dex+siRNA)作用24 h后,3T3、C2C12和PC12这3种正常细胞的存活率均在90%以上,且给药后大鼠脏器的病理切片与正常大鼠并没有显著变化,以上结果表明HAPKNPs/(Dex+siRNA)具有很高的安全性。综上,本文构建的透明质酸修饰酸敏感共传递纳米载体能够有效的将药物递送至RA发病部位并发挥作用,同时MCL-1 siRNA与Dex的联合用药能够更好的抑制RA的进程。这为以后RA的靶向治疗和药物联合治疗提供了一种新思路。
【图文】：

长扫描,全波,峰面积,浓度

图 2.2 Dex 全波长扫描Figure 2.2 The UV spectrum of Dex.2 标准曲线的绘制Dex 的浓度对应峰面积的标准曲线如图 2.3，其中回归方程为 y = 37699503，，R2= 1。结果表明在浓度为 0 μg/mL-320 μg/mL 的范围内浓度与峰面积关系良好。

曲线,溶液,曲线,峰面积

图 2.2 Dex 全波长扫描Figure 2.2 The UV spectrum of Dex2.4.2 标准曲线的绘制Dex 的浓度对应峰面积的标准曲线如图 2.3，其中回归方程为 y = 37699x +21503，R2= 1。结果表明在浓度为 0 μg/mL-320 μg/mL 的范围内浓度与峰面积线性关系良好。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.22;R943

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