钙通道阻滞剂与氟康唑联用抗白色念珠菌的体内作用及对毒力因子的影响

发布时间：2020-05-29 12:24

【摘要】：研究背景近年来,机会性真菌感染的发病率逐年升高,已成为造成人类疾病的重要原因之一。特别是对于免疫力低下的患者,如艾滋病患者,恶性肿瘤患者。念珠菌引起的全身性真菌感染在医院感染中排第四位。非白念珠菌分离率的增加和念珠菌的耐药率增加给临床感染的治疗带来了巨大的挑战。白色念珠菌(Candida albicans,CA)是造成念珠菌病最常见的病原体,它不仅能引起表皮念珠菌病,还能引起免疫力低下的患者发生危急生命的系统性真菌感染。当前抗真菌药物可用的种类很少,例如:多烯,唑类,嘧啶类和烯胺类等,其作用机制主要是针对细胞壁和细胞膜以及抑制DNA合成。此外,上述大部分药物都能使人体表现出明显的不良反应,如伏立康唑引起的视觉障碍、两性霉素B引起的肾脏毒性、伊曲康唑引起的心力衰竭。在这些药物中,如棘白菌素,其临床应用由于其高昂的费用而受到限制。值得一提的是,念珠菌的耐药现象越来越严重,特别是对于作为临床常用的抗菌药首选氟康唑。因此,寻找对抗耐药真菌的药物与策略迫在眉睫。针对临床上能够应用的抗真菌药物很少且出现耐药现象,越来越多的研究者希望通过联合用药这一方式来克服真菌的耐药难题,而不是仅专注于高成本、长周期的新药的研制开发。对于联合治疗,它通常包括多种抗真菌剂间的组合及现有抗真菌剂和非抗真菌剂间的组合。然而,由于多种抗真菌药间的联用成本高,且易增加患者的用药不良反应,所以越来越多的研究者转向关注非抗真菌药与现有的抗真菌药之间的联用,例如,布地奈德和氟康唑、苯丁酸与氟康唑等的联用均可显著地抑制耐药白色念珠菌的生长。因此,抗真菌药与非抗真菌药的联合应用已成为近年来克服真菌耐药的重要研究手段,也是本课题组多年来的研究方向。钙离子作为真核细胞中的第二信使,在细胞信号的转导及细胞生存中扮演着重要角色。真菌中的钙-钙调磷酸酶信号通路由很多元件组成,包括钙通道、感应器、转录因子、转换器、钙离子泵以及许多与钙相关的蛋白和酶。上述大部分元件与真菌中许多生理过程密切相关,而且很多研究表明钙和钙调磷酸酶介导了唑类耐药性,表明了钙信号通路在介导唑类耐药中起到了非常关键的作用。钙通道阻滞剂是一类临床常用药物,它常用于高血压、心绞痛等心脑血管疾病,安全性较高,包括氨氯地平、贝尼地平、氟桂利嗪、地尔硫卓等。基于钙离子在真菌耐药性方面的重要作用,本课题组在前期研究中发现多个钙通道阻滞剂与氟康唑联用有明显的体外协同抗耐药白色念珠菌的作用,本课题将在前期实验的基础上,进行钙通道阻滞剂(硝苯地平、氨氯地平、贝尼地平、氟桂利嗪)与氟康唑联用的体内作用研究,并进一步探讨其体内作用机制,这不仅可以拓展钙通道阻滞剂的临床应用,还将对寻找克服白色念珠菌耐药的方法提供实验数据与新的思路。研究目的前期研究表明,氟康唑联合钙通道阻滞剂在体外对白色念珠菌具有显著的协同作用。本研究在此基础上,进一步探讨钙通道阻滞剂是否能增加氟康唑体内抗真菌作用,并探究其体内作用机制。研究方法本研究所用到的白色念珠菌为CA10,钙通道阻滞剂为氟桂利嗪、硝苯地平、氨氯地平和贝尼地平。使用大蜡螟作为真菌体内侵染模型,测定氟康唑与钙通道阻滞剂联用对感染后大蜡螟的生存率、载菌量和组织病理变化,从三个方面评价二者的体内联合作用。生存率试验:将感染CA10的大蜡螟幼虫分为四组,包括对照组、钙通道阻滞剂药物单用组、氟康唑组、氟康唑与钙通道阻滞剂药物联用组。每24 h观察一次,并记录幼虫的存活情况,连续记录4天,绘制生存曲线。载菌量试验:将四组注射药物的大蜡螟幼虫搅碎,稀释并将其置于无菌酵母膏胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)琼脂固体培养基上培养,统计菌落数并计算每只幼虫的载菌量。组织病理学试验:用过碘酸雪夫染色(Periodic Acid-Schiff stain,PAS)对大蜡螟组织切片进行染色,观察切片内形成团块的情况,判断大蜡螟组织的损伤情况,从而进一步确定氟康唑(fluconazole,FLC)与钙通道阻滞剂(Calcium channel blockers,CCBs)对体内白色念珠菌耐药菌感染的联合抗真菌作用。本研究还从毒力因子方面进行了进一步的试验,通过卵黄培养基法,测定二者联用后对耐药白色念珠菌毒力因素胞外磷脂酶的影响。研究结果生存率试验:与对照组或药物单用组相比,药物联用组的生存率明显升高。对照组与药物单用组无明显变化;联用组的大蜡螟幼虫生存率约为单用组与对照组的一倍。与此同时,通过对比氟康唑分别与四种钙通道阻滞剂联用结果可以看出,FLC与氨氯地平联用时的大蜡螟生存率要明显高于其他三组,提高生存率效果最好。载菌量试验:对照组与钙通道阻滞剂单用组无明显差异;相比于对照组,氟康唑药物单用组的载菌量相对减少;而药物联用组的载菌量则明显大幅度降低,联用效果最好。组织病理学试验:与对照组或药物单用组相比,大蜡螟幼虫体内的感染斑块在药物联用组中明显减少。卵黄培养基法:与对照组的Pz值(0.77±0.03)相比,药物单用组无明显差异。氟康唑组:0.79 ± 0.01;贝尼地平组:0.76 ± 0.06;氨氯地平组:0.74 土0.08;硝苯地平组:0.75 ± 0.09;氟桂利嗪组:0.76 ± 0.04;而药物联用组中白色念珠菌的胞外磷脂酶活性则显著降低,其中,FLC与氨氯地平联用组未出现沉淀圈,则表明该组合能够完全抑制胞外磷脂酶的活性。结论以上结果提示,氟康唑与钙通道阻滞剂(氟桂利嗪、硝苯地平、贝尼地平、氨氯地平)联用与药物单用组相比作用于白色念珠菌感染,其抗真菌作用明显增强。其作用机制可能与抑制耐药白色念珠菌胞外磷脂酶的活性有关。其中,氟康唑与氨氯地平联用组的体内联合抗白色念珠菌作用最为明显。这些结果与先前的体外研究一致,均表明氟康唑与钙通道阻滞剂联用能够对抗耐药白色念珠菌,且其作用机制与白色念珠菌胞外磷脂酶的活性有关。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

【相似文献】