线粒体靶向性铜配合物通过调控肝癌细胞自噬介导线粒体凋亡的作用及分子机制研究

发布时间：2020-05-29 18:36

【摘要】：[背景]肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是一种全球最常见的肝原发性恶性肿瘤,其具有起病隐匿、发病率高、生长迅速、侵袭性强、致死率高、预后差等特点,目前尚缺乏有效的治疗手段。对于中晚期肝癌来说,除局部治疗具有短期疗效外,索拉菲尼是当前唯一被批准用于临床的靶向性治疗药物,然而快速耐药性的产生严重限制其临床疗效。HCC对化疗药物的敏感性低于许多其他肿瘤,其化疗抗性是药物治疗HCC失败的主要原因之一,且其发生机制极为复杂。因此迫切需要深入研究HCC的病理机制及化疗抗性背后的新干预靶标,并研发安全有效的新型癌症治疗药物具有重大意义。近年来,金属药物在治疗各种癌症方面取得了显著疗效,其中铂类配合物已在临床上有不同程度的应用。然而,由于耐药性等副作用的产生,寻找抗肿瘤活性强、毒性低且能克服耐药性的配合物是目前配合物药物研究的关键。铜配合物的生理分布、细胞内聚集及抑制肿瘤细胞生长的过程与铂配合物均有不同程度的差异,为铜配合物作为抗肿瘤药物克服耐药性带来了可能。本课题研究组前期发现,三吡啶类铜配合物可以有效地与肿瘤细胞DNA结合,并通过氧化切割原理将DNA切割成不同组分,但是并不足以明显改变肿瘤细胞的恶性生物学行为,原因可能是肿瘤细胞可以及时地对DNA损伤进行修复,这也是耐药性产生的原因之一。为了进一步优化上述三吡啶类铜配合物,课题组首次将线粒体靶向基团三苯基膦(Tri-phenyl-phosphine,TPP)引入该配合物中得到一种全新的铜配合物[Cu(ttpy-tpp)Br2]Br(以CTB表示),TPP可以为该配合物增加离域电荷,同时其亲脂性的特性有利于聚集到线粒体上。通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP)等确证了CTB具有明显的线粒体靶向功能,且具有良好的水溶性及DNA切割活性。然而,CTB靶向肿瘤细胞线粒体表现出抗肿瘤活性的作用及分子机制尚不完全清楚,亟需进一步深入探究。本研究旨在明确CTB对肝细胞癌的抗肿瘤效应,并阐明其作用作用的分子机理,为今后线粒体靶向性配合物药物的设计及临床应用提供理论依据。[方法]本论文研究采用体外、体内两部分实验进行开展:1、体外研究主要选取人肝癌细胞SMMC-7721细胞为研究对象。首先以MTT法筛选CTB最适用药浓度、检测对肝癌细胞的增殖抑制作用;以透射电镜、Janus green染色、JC-1染色法考察CTB对SMMC-7721细胞线粒体结构的影响;后利用海马XF96(Seahorse)细胞外流量分析仪检测耗氧率、外酸化率等来测定线粒体功能的变化;再采用AnnexinV-FITC/PI染色、TUNEL染色,检测CTB对肝癌细胞凋亡的作用;以DCFH-DA染色法检测肝癌细胞内ROS的堆积;透射电镜、MDC荧光、质粒转染等手段检测肝癌细胞自噬的发生;利用线粒体荧光探针考察CTB对线粒体分裂的影响;利用免疫荧光双染、Western blot检测目的蛋白表达与活化。2、体内研究采购体重约18-22g的4周龄雄性裸鼠(BALB/c-nu/nu),以建立人肝癌SMMC-7721细胞裸鼠异种移植瘤模型。成功构建后,卡尺定期测量肿瘤大小,建立生长曲线。通过游标卡尺测量长直径(a)和短直径(b),并且通过公式计算肿瘤体积,即体积(V)=a×b2/2。当肿瘤达到时平均大小为150 mm3,根据实验所需将小鼠随机分组(每组8只动物)。采用腹腔注射药物,药物CTB悬浮于无菌PBS中并每周注射3次,共两周。实验结束后,分离完整肿瘤、肝脏等器官并称重,拍摄肿瘤并称重以计算肿瘤抑制率。将肿瘤组织部分切除固定在4%多聚甲醛中用于IHC/IF检测,或固定在2.5%戊二醛中用于透射电镜检测,剩余部分于液氮中冷冻用于Western blot检测。[结果]体外研究结果显示,CTB以时间、剂量依赖性方式抑制多种肝癌细胞的生长。透射电镜、Janus green染色、JC-1染色等检测结果显示,CTB破坏线粒体结构、导致线粒体膜电位的下降,同时细胞外酸化率、氧消耗率检测结果显示CTB抑制肝癌细胞糖酵解及氧消耗水平。AnnexinV-FITC/PI染色、TUNEL染色结果显示CTB诱导肝癌细胞凋亡,伴随着肝癌细胞内ROS的堆积以及p53蛋白的线粒体转位。透射电镜、MDC荧光等检测结果显示CTB能够提高肝癌细胞自噬水平;GFP-LC3荧光报告基因显示LC3-Ⅱ的活化,同时CTB激活自噬AMPK/mTOR/ULK1信号通路;线粒体和溶酶体的荧光共定位检测显示线粒体自噬的发生,并伴随着线粒体自噬蛋白Parkin/PINK1表达的升高。进一步的Mito-tracker Green荧光检测显示CTB诱导线粒体的过度分裂,并伴随着线粒体分裂蛋白Drp1的活化;Drp1特异性抑制剂Mdivi-1在抑制线粒体分裂的同时降低线粒体自噬蛋白的表达,削弱CTB对线粒体自噬的诱导。最后的检测结果显示,自噬抑制剂3-MA抑制CTB诱导的肝癌细胞线粒体功能障碍;Mdivi-1抑制CTB诱导的p53线粒体转位及凋亡水平,细胞自噬的诱导对CTB诱导的细胞凋亡具有一定的促进作用。体内研究结果显示,CTB处理后人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织质地较硬、发白,抑瘤率及生长曲线结果显示CTB以剂量依赖性方式抑制肿瘤组织的生长;TUNEL染色、凋亡相关因子的检测结果显示CTB诱导能够诱导肿瘤组织的凋亡。同时,CTB增加肿瘤组织中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Parkin、PINK1的水平,降低p62的水平;Drp1抑制剂Mdivi-1能够削弱这些效应,线粒体分裂的抑制能够影响自噬过程。[结论]体内、体外研究实验结果充分说明,CTB具有良好抗肝癌活性,与其线粒体靶向特性密不可分。CTB诱导肝癌细胞线粒体功能障碍,并通过ROS依赖性的p53线粒体转位诱导线粒体凋亡的发生,从而发挥其抗肿瘤效应。CTB通过Drp1依赖性的线粒体分裂促进线粒体自噬的发生,并在CTB诱导的线粒体凋亡中发挥一定的促进作用。本研究为靶向调控线粒体功能的抗肝癌细胞治疗药物的研发提供了一定的实验依据。
【图文】：

化学结构

的线粒体靶向能力，且对线粒体ＤＮＡ造成明显的方式不同［２Ｇ］。铜配合物就己被证明具有辐射保护和力，并能迅速地从辐射引发组织变化中恢复过来，有关［２１，２２］。在很多研究中，铜配合物的毒活性多与配体对肿瘤具有明显毒活性，但是铜配合物的配体中地基团的研究仍然较少。因此，对于具有靶向性铜配点。逡逑线粒体靶向铜配合物逡逑组前期研究发现，三吡啶类铜配合物可以有效地与ＤＮＡ切割成不同组分［２３］。但单纯切割ＤＮＡ并不足为。近年来研究发现，经过改造后的铜配合物不仅与体中的某些蛋白结合，从而发挥更好的抗肿瘤效应。物，将三苯基膦（ＴＰＰ）引入配合物结构中ｐｐ）Ｂｒ２］Ｂｒ邋（以邋ＣＴＢ邋表本）［２４］。逡逑

生长曲线,动物实验,方案

－ｇ词养在无菌条件下，提供１２邋ｈ光－暗循环照射、足够的水和食物。为了建植模型，在对数期收获ＳＭＭＣ－７７２１细胞，并以ｌｘｌ0７／２００ｐＬ浓度的细胞小鼠的右腋下以诱导肿瘤生长。细胞移植后，生长约五天观察模型是否卡尺测量肿瘤大小，并且每３天估计肿瘤体积。为了建立生长曲线，通过直径Ｕ）和短直径（ｂ），并且通过公式计算肿瘤体积，即体积（Ｖ）邋＝ａｘｂ到时平均大小为１５０邋ｍｍ３，，将小鼠随机分成五组（每组８只动物）：正常ｓ－Ｐｔ邋（１０ｍｇ／ｋｇ）＿邋阳性药对照组、ＣＴＢ邋治疗低（２．５邋ｍｇ／ｋｇ）、中（５邋ｍｇ／ｋｇ）、）剂量组。采用腹腔注射药物，ＣＴＢ、Ｃｉｓ－Ｐｔ悬浮于无菌ＰＢＳ中并每周注型组接受相同体积的盐水，注射两周。每３天记录体重、量取肿瘤大小。逡逑验结束后，每只大鼠称重并腹腔注射１０％水合氯醛（３５０邋ｍｇ／ｋｇ）麻醉，离完整肿瘤、肝脏等器官并称重，拍摄肿瘤并称重以计算肿瘤抑制率。抑制组的平均肿瘤重量－治疗组的平均肿瘤重量）／对照组的平均肿瘤重量ｘｌ组织的部分切除在４％多聚甲醛中固定用于ＩＨＣ等测定，部分切除固定于剩余部分于液氮中冷冻。逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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