pH敏感改性壳聚糖纳米载药系统的构建及其抗炎抗氧化作用研究

发布时间：2020-06-08 19:52

【摘要】：心血管疾病是全球发病率和死亡率最高的疾病之一。尽管国家对其投入逐年增加,但死亡率并没有降低,给人类的健康造成严重威胁。动脉粥样硬化是心血管疾病发病的主要原因,动脉粥样硬化的病理过程是一种慢性的炎症过程,涉及胆固醇沉积物的逐渐积累和动脉壁内斑块的沉积,最终导致动脉管腔狭窄,甚至阻塞。炎症反应在动脉粥样硬化发病过程中起重要作用。临床上药物治疗是防治此类疾病的重要手段之一,且需终身用药。但大多数药物在靶部位作用时间短,毒副作用大,靶向性差,故其临床治疗效果十分有限。目的:本研究以辛烯基琥珀酸酐对壳聚糖进行修饰改性,合成新型辛烯基琥珀酰化修饰壳聚糖(OSA-CS),构建pH敏感OSA-CS两亲性聚合物纳米载体,制备响应于炎症性病灶酸性微环境而释放药物的纳米载药系统,并对纳米载药系统进行抗炎抗氧化活性评价。方法:(1)采用直接酰化法将辛烯基琥珀酸酐(OSA)接枝壳聚糖,合成辛烯基琥珀酰壳聚糖(OSA-CS);用核磁共振氢谱法和红外光谱法对OSA-CS的结构进行表征;以酸碱滴定法检测OSA-CS的取代度和溶解性能;采用芘荧光探针法测定其临界聚集浓度;(2)以溶剂注入法包载姜黄素(CUR)和槲皮素(QUE)制备纳米载药系统;采用紫外分光光度法测定纳米载药系统的包封率和载药量;采用激光粒度测定仪测定其粒径、多分散系数和Zeta电位,并以粒径、多分散系数和Zeta电位为指标考察了纳米载药系统的药物载体比和不同pH值条件对纳米粒的影响及其稳定性;以透射电镜观察纳米载药系统的形态;以透析法考察了其体外药物释放特性;(3)用CCK-8法检测细胞毒性和细胞存活率;利用溶血和粘附实验评价OSA-CS的血液相容性;(4)用DPPH法评价纳米载药系统的抗氧化活性;采用荧光显微镜观察CUR-OSA-CS的细胞摄取情况;以脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞为炎症模型,考察纳米载药系统对活性氧(ROS)的清除能力和对巨噬细胞增殖活性的影响。结果:(1)辛烯基琥珀酸酐接枝壳聚糖,合成OSA-CS,取代度随辛烯基琥珀酐和壳聚糖的摩尔比的提高而提高,其取代度可达38.89%;与CS相比,取代度为16.9%~27.9%的OSA-CS具有良好的水溶性;OSA-CS的临界聚集浓度(CAC)为0.027 mg/mL;(2)CUR-OSA-CS和QUE-OSA-CS的载药量为14.4%、12.1%,包封率为84.3%、90.0%;粒径为171.7、189.8 nm,多分散系数(PDI)为0.145、0.181,Zeta电位为-1.57、-1.74 mV;将CUR和QUE以1:1共同包载制备CUR+QUE-OSA-CS,其粒径为166.6 nm,PDI为0.197,Zeta电位为-1.69 mV,表明载药纳米粒的粒径较小,且粒径分布均一;环境pH对载药纳米粒的粒径和Zeta电位影响较大,当pH逐渐降到6.0时,纳米粒表面电荷由负电位反转为正电位,且PDI显著增大,粒径分布出现多峰现象,在透射电镜下观察到纳米粒子膨胀裂解,显示出良好的pH敏感性;且CUR-OSA-CS和QUE-OSA-CS的药物释放度受释放介质的pH值的影响,在pH 6.0酸性释放介质中具有最高的释放度,可达到靶向给药的目的;并且在48 h内缓慢释放药物,具有良好的缓释性;在储存和血清稳定性试验中,载药纳米粒的粒径均无明显变化;(3)OSA-CS、CUR-OSA-CS、QUE-OSA-CS的细胞毒性分析显示无毒性;另外,OSA-CS无溶血性和血小板粘附,表明OSA-CS与壳聚糖相比具有更加优良的血液相容性(P0.001);(4)CUR-OSA-CS、Free CUR、QUE-OSA-CS、Free QUE、CUR+QUE-OSA-CS、Free CUR+QUE对DPPH自由基的半抑制浓度IC_(50)分别为3.97、4.98、1.29、1.89、1.95、1.49μg/mL,表明与游离药物相比,纳米载药系统具有更高的抗氧化能力(P0.05);细胞摄取实验结果显示,纳米载药系统比游离药物具有更高的细胞摄取率(P0.01);而且CUR-OSA-CS、QUE-OSA-CS、CUR+QUE-OSA-CS比游离药物能更加有效地抑制LPS诱导的巨噬细胞内活性氧的产生(P0.01)和LPS诱导的炎症性细胞增殖(P0.05),尤其发现包载两种中药组分的纳米载药系统具有协同效应(P0.05),可发挥更强的抗炎抗氧化作用。结论:本课题制备出两种中药组份同时装载的pH敏感性新型可溶性OSA-CS纳米药物载体,对姜黄素和槲皮素持有较高的包封率和载药量,粒径较小,且粒径分布均一,可充分发挥两种药物联合应用时的协同作用,pH敏感性智能响应靶向递送又能降低药物对正常组织细胞的损害,而且OSA-CS可响应环境pH变化而使药物缓慢平稳释放,使药物在靶部位的作用时间得到延长,提高药物的抗炎抗氧化治疗作用,提升药物的治疗效果,降低药物的毒副作用。上述研究结果为炎症微环境pH敏感缓释靶向制剂的临床应用提供了重要的实验数据。
【图文】：

示意图,合成反应,示意图,溶液

concentration,CAC）。芘溶液的配制：称取 12.0mg 芘，加适量甲醇超声溶解，得浓度为 6×10-3mM/L 的芘溶液。用 0.5 mL 移液管精密量取 0.25 mL 浓度为 6×10-3mM/mL 的芘溶液，加甲醇定容，得 3×10-5mM/L 的芘甲醇溶液，，4 ℃保存备用。用 0.2 mL 移液管取 0.2 mL 3×10-5mM/L 的芘甲醇溶液，取适量的 OSA-CS溶液置于上述容量瓶中，得到系列不同浓度的 OSA-CS 溶液（含浓度为 6×10-7mM/L 的芘溶液），37 ℃恒温震荡 24h。用荧光分光光度法在激发波长为 334nm下扫描各样品在 350~450 nm 的荧光强度，通过 372 nm 和 382 nm 处的荧光强度比值绘制 I372/I382与 LogC 的曲线图，计算 CAC。2.3 结果与讨论2.3.1 OSA-CS 的合成本研究将壳聚糖和辛烯基琥珀酸酐置于均相条件，经直接酰化法合成了OSA-CS，反应较为完全且后处理简单。合成反应示意图如图 2.1 所示。

核磁共振氢谱,特征峰,亚甲基

2.3.2 结构表征2.3.2.1 核磁共振氢谱分析OSA、CS 和 OSA-CS 的核磁共振氢谱见图 2.2。由图 2.2 可知，δ 0.82 处为OSA的甲基(CH3)特征峰，δ1.25处为OSA的 4’,5’,6’,7’位亚甲基(CH2)特征峰，δ1.95 处为 OSA 的 3’位亚甲基(CH2)特征峰，δ2.7 处为 OSA 的 3 位亚甲基(CH2)特征峰，δ=3.0 处为 OSA 的 2 位次甲基(CH)特征峰，δ=5.38 和 5.53 分别为 OSA的 3’和 2’碳碳双键（RCH=CHR）特征峰，在 OSA-CS 的核磁共振氢谱中均能检测到 OSA 的特征峰
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943

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