甾体激素药物EAD和多肽HYD-PEP06的临床前药代动力学研究

发布时间：2020-06-11 17:32

【摘要】：目的:17-乙炔基雄甾-5-烯-3,17-二醇(EAD),由5-雄甾烯二醇(5-AED)于17位碳引入乙炔基得到。EAD相较于5-AED具有更好的抗放射活性。目前本研究拟建立生物基质中EAD的定量分析方法并考察其临床前体内药动学特征,为后续药物设计与申报提供数据基础。HYD-PEP06是以首个血管内皮抑素抗癌药物-恩度(Endostar)为基础,利用固相合成法合成的30个氨基酸组成的多肽。目前拟申报生物药注册分类1.1类新药。因此,本研究拟考察其临床前体内药代动力学特征,为此多肽的申报以及进一步临床试验人体的药代动力学研究提供数据支持与参考。方法:采用液质联用定量分析方法,分别完成两种药物的质谱方法的建立与优化,液相方法的建立与优化。完成生物样品中甾体激素EAD和多肽HYD-PEP06定量分析方法的建立与完整的方法学验证。应用完整验证的定量方法完成EAD和HYD-PEP06的临床前体内药代动力学研究。结果:1.测定生物样品中EAD含量的LC-MS/MS定量分析方法的建立与确证建立并确证了测定大鼠血浆中抗ARS甾体激素药物EAD浓度的HPLC-MS/MS方法,此方法简单、灵敏、专属性强,无基质效应。大鼠血浆中,EAD在5~1000 ng·mL~(-1)浓度范围内线性关系良好(R0.99),定量下限为5 ng·mL~(-1)。生物样品前处理采用沉淀蛋白的方法。EAD的批内RSD为4.35%~12.69%,批间RSD为4.38%~13.89%,RE%为-6.48%~0.01%。绝对回收率为81.54%~88.85%,方法无基质效应、无残留效应。甾体激素EAD储备液4℃放置7天稳定;血浆样本室温放置6h、-20℃放置7天、-20℃反复冻融3次稳定。处理后样品进样仓(4℃)放置24h稳定性良好。该分析方法能够满足EAD临床前大鼠体内药代动力学研究要求。2.大鼠单剂量口服灌胃给药甾体激素EAD后的药代动力学研究采用经过确证的LC-MS/MS方法测定Wistar大鼠单剂量口服灌胃给药EAD(100 mg·kg~(-1))后EAD的血药浓度,血浆中的药物具有明显的吸收、消除过程。用WinNonlin 6.4,非房室模型计算动力学参数。T_(max)为2h,即EAD口服给药后2h药物吸收达峰。药时曲线下面积AUC为(178.03±71.72)h·ng·mL~(-1),消除半衰期T_(1/2)为(2.15±0.87)h,平均血浆清除率CL为(527.49±207.55)L·h~(-1)·kg~(-1),表观分布容积V_z为(1590.79±702.88)L·kg~(-1)。同时,数据表明,在给药后8-12h内出现跳点,即EAD的吸收可能存在双吸收的现象。初步推测,EAD在大鼠体内可能存在肠肝循环。另根据药物的血药浓度来看,100 mg·kg~(-1)的EAD口服灌胃给药后,体内血药浓度非常低,平均最高浓度为(28.92±6.02)ng·mL~(-1),给药后12h后血浆中基本检测不到原型药物EAD。3.测定生物样品中HYD-PEP06含量的LC-MS/MS定量分析方法的建立与确证本文分别建立并确证了测定大鼠全血中HYD-PEP06含量的LC-MS/MS定量分析方法,此方法简单、灵敏、专属性强。经考察,此多肽无物理吸附效应。通过在流动相及洗针液中加入甲酸可以有效去除残留效应并且提高响应。通过对酸、抗氧化剂、酶抑制剂及样品处理温度——室温/冰浴等影响HYD-PEP06溶液及全血中稳定性条件的考察,确定了HYD-PEP06储备液中加酸,冰浴上完成生物样品前处理的实验条件。生物样品前处理采用沉淀蛋白的方法。大鼠全血中,HYD-PEP06在10~2000 ng·mL~(-1)范围内具有良好的线性关系(R0.99)。HYD-PEP06的批内RSD为4.81%~9.42%,批间RSD为3.13%~4.87%,RE%为-5.06%~8.54%。绝对回收率为57.35%~61.41%,本方法无基质效应、无稀释效应。多肽HYD-PEP06及内标储备液、工作液在室温放置5h稳定性良好,样品处理过程中在冰浴上30min之内稳定,处理后样品在-80℃放置2月、4℃放置2周、进样仓(4℃)放置48h稳定性良好。该分析方法能够满足HYD-PEP06临床前药代动力学研究。4.Wistar大鼠静脉注射HYD-PEP06后的药代动力学研究大鼠静脉注射HYD-PEP06注射液后,其代谢动力学特征如下:给药剂量为3.3,30,90 mg·kg~(-1),给药剂量比例为1:9:27,AUC_(last)分别为(702.63±126.47)h·ng·mL~(-1),(7932.19±3606.62)h·ng·mL~(-1),(21104.82±4396.20)h·ng·mL~(-1),其AUC比值为1:11.3:30,与给药剂量之比基本呈比例正相关增加。由上述结果推测,在3.3~90 mg·kg~(-1)剂量测试范围内,HYD-PEP06在Wistar大鼠体内基本呈线性动力学特征。低、中、高剂量给药后首个采血点1min即为血药浓度C_(max)分别是(11252.5±1607.4)ng·mL~(-1),(126987.5±45697.2)ng·mL~(-1),(442125.0±96828.9)ng·mL~(-1),半衰期T_(1/2)分别为(1.35±0.07)min,(2.84±0.10)min,(8.10±1.00)min,因为本多肽消除速度较快,低中高剂量组检测到的血药浓度时间点不同,计算半衰期T_(1/2)采用的时间点不同,导致的低、中、高剂量半衰期T_(1/2)的差别没有生物学意义。5.Wistar大鼠皮下注射HYD-PEP06后的药代动力学研究大鼠皮下注射HYD-PEP06后,其代谢动力学特征如下:给药剂量为30 mg·kg~(-1),给药后5min药物在体内吸收达峰,即为血药浓度C_(max)是(780.4±392.1)ng·mL~(-1),AUC_(last)为(249.58±74.83)h·ng·mL~(-1),半衰期T_(1/2)为(9.82±2.32)min。与同剂量静脉给药相比,其绝对生物利用度为3.15%±0.94%。结论:1.本研究建立的定量分析方法能够满足EAD临床前大鼠体内药代动力学研究要求。初步推测,EAD在大鼠体内可能存在肠肝循环。另根据药物的血药浓度来看,100 mg·kg~(-1)的EAD口服灌胃给药后,体内血药浓度低,给药后12h后血浆中基本检测不到原型药物EAD。2.本研究建立的定量分析方法能够满足HYD-PEP06临床前药代动力学研究。在3.3~90 mg·kg~(-1)剂量测试范围内,HYD-PEP06在Wistar大鼠体内基本呈线性动力学特征。大鼠皮下注射HYD-PEP06后,与同剂量静脉给药相比,其绝对生物利用度为3.15%±0.94%。
【图文】：

部分 测定生物样品中 EAD 含量的液质联用分析的建立与验证首次建立并确证测定生物样品中甾体激素类药物 EAD 浓度的-MS/MS 定量分析方法，根据原国家药品监督管理局 2014 年颁学药品临床前药代动力学研究指导原则ǐ及 2015 年版ǎ中国药关内容，开展 HPLC-MS/MS 方法学确证，为研究 EAD 临床前药研究提供技术条件 内标选用结构相似的甾体激素类药物 5-AE

（A）、LLOQ样本（B）、大鼠口服灌胃给药后2h血浆样hromatograms of blank plasma sample, blank plasma sample spa sample from Wistar rat 2.0 h after oral administration of EAD (B) and (C).定量下限血浆100 μL分别依次加入一系列浓度梯度的度为 5，25，50，100，，250，500，1000 ng .6 血浆样品前处理方法操作 横坐标为血浆中与内标的峰面积之比，以加权最小二乘法（直线回归方程即为标准曲线方程 表 1-3 列析方法测定 3 个分析批的标准曲线及参数
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R969.1

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本文编号：2708229