芳香族氨基酸解氨酶的克隆表达及其在药物合成中的应用研究

发布时间：2020-06-13 11:22

【摘要】：芳香族氨基酸解氨酶为苯丙氨酸解氨酶(PAL),酪氨酸解氨酶(TAL)和组氨酸解氨酶(HAL)的总称。在自然条件下芳香族氨基酸解氨酶发生去氨基反应,将芳香族氨基酸的氨基水解掉,在一定条件下也可发生可逆反应。苯丙氨酸和组氨酸及其类似物可以作为多种药物的中间体,例如美法仑、免疫抑制剂和一些抗病毒药物。本课题通过基因组挖掘的方法从Streptomyces bottropensis菌株中发现了一种新型的组氨酸解氨酶SbHAL。并将组氨酸解氨酶SbHAL的基因片段整合到pET-41载体质粒上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,成功表达后用镍柱纯化和分子筛纯化后得到纯蛋白,并对其进行了性质测定和底物特异性研究。使用Discovery Studio 2.5对SbHAL进行同源建模,完成酶与底物对接实验,得到了 SbHAL与底物复合物的三维结构,推测了 SbHAL的催化中心和活性位点。对影响组氨酸解氨酶SbHAL催化活性的因素进行了研究,包括温度、pH以及金属离子对酶活的影响。实验表明在40 ℃,pH 10.0的条件下酶的活性最高。终浓度为0.1 mM的Na+和Fe2+对酶的活性有较为明显的促进作用,0.1 mM的Zn2+对酶的活性有强烈的抑制作用。底物特异性的研究显示该组氨酸解氨酶SbHAL对多种组氨酸类似物也有较高的活性,对于抗病毒药物和免疫抑制剂的制备具有潜在的意义及应用价值。本课题还进一步扩展了蓝藻苯丙氨酸解氨酶Anabaena variabilis PAL(AvPAL)的适用底物。并首次在苯丙氨酸及其类似物的氨基上进行了修饰。实验结果表明,在苯丙氨酸及其类似物的氨基上进行修饰后,该酶也依然存在较好的活性,这为用新方法合成药物提供了可能。
【图文】：

药物中间体,肉桂酸,解氨酶

所有含苯丙烷骨架的物质，在苯丙烷类代谢途径中ＰＡＬ是被研宄最多的酶。苯逡逑丙氨酸解氨酶是连接多种代谢途径的酶。通过莽草酸途径产生的Ｌ－苯丙氨酸，，逡逑经过苯丙氨酸解氨酶作用脱氨基后转化为肉桂酸，如图１－２所示ＰＡＬ在一逡逑定的条件下也可以发生逆反应，将肉桂酸转换成Ｌ－苯丙氨酸ｔ１４＿１６］。逡逑１９６１年ＰＡＬ首次被报道，Ｋｏｕｋｏｌ等从绿色植物中找到了苯丙氨酸解氨酶，逡逑并将其提纯出来得到了纯蛋白［１７］。之后随着对苯丙氨酸解氨酶的研究不断深入，逡逑在一些真菌和原核生物中也找到了邋ＰＡＬ。随后在１９６６年，Ｏｇａｔａ等在对组氨酸、逡逑酪氨酸、苯丙氨酸的微生物代谢的研究中，找到了一些红酵母属中菌种可以将逡逑Ｌ－苯丙氨酸作为唯一的碳源和氮源进行生长，并且发现培养基中有肉桂酸生成逡逑２逡逑

药物中间体,类似物,解氨酶

在一定条件下可进行逆反应，生成Ｌ－苯丙氨酸。Ｌ－苯丙氨酸是甲状腺素、美法逡逑仑等药物的重要中间体，并且一些Ｌ－苯丙氨酸的类似物也可以作为药物中间体，逡逑或者是具有作为药物中间体的潜在价值，如图１－５所示。所以寻找新的苯丙氨酸逡逑解氨酶和扩展新的ＰＡＬ的作用底物具有重要意义，可以提高Ｌ－苯丙氨酸的产率、逡逑找出ＰＡＬ新的使用底物，为生产其他新的药物中间体提供可能。本课题主要从逡逑以下几个方面进行研究：逡逑１．找到新的组氨酸解氨酶并进行纯化逡逑７逡逑
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914

【参考文献】