用于干眼治疗的他克莫司复合纳米晶的制备

发布时间：2020-06-13 18:47

【摘要】：目的干眼(dry eye,DE)属于最常见眼表疾病。研究发现,干眼的致病因素有很多,包括:年龄、饮食、戴隐形眼镜、环境污染以及过度用眼等。在临床上干眼的治疗药物有很多种,其中主要是利用人工泪液来润滑和保湿眼表,进而来改善和缓解症状。然而,近些年达成的共识是非感染性的免疫性炎症在干眼的致病过程中起到决定性作用。但是由于临床上并没有合适治疗干眼免疫性炎症的药物,所以找到一种合理的治疗药物迫在眉睫。他克莫司(Tacrolimus,FK506)是一种免疫抑制的新型药物。研究表明,生理状态下他克莫司能够阻止T细胞核脱磷酸。这一作用从根本上抑制了淋巴细胞因子的生成,从而阻止炎症因子的释放,起到调节免疫的作用。由于他克莫司属于疏水性药物,生物利用度低,因此构建他克莫司纳米晶联合人工泪液的给药体系有望解决以上问题。本研究拟首先通过超声和重结晶方法获得他克莫司纳米晶,然后利用层层自组装(LbL)技术在他克莫司纳米药物表面修饰人工泪液(羧甲基纤维素钠,CMC)。从而达到保湿、免疫调节的联合作用治疗干眼,提高药物疗效和改善患者用药的依从性。方法1.首先利用超声法和重结晶法制备出尺寸、形状可控的药物晶体,然后进一步摸索超声法的超声时间,重结晶法探讨滴药速率、匀浆转速、以及稳定剂等因素对他克莫司纳米晶形成的影响。最后,通过扫描、透射电子显微镜等表征他克莫司纳米晶。2.壳层材料为人工泪液羧甲基纤维素钠(CMC)和聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)。利用层层自组装技术,将CMC负载在纳米级别的他克莫司颗粒。LbL方法通常是将壳层材料通过静电力等弱相互作用力沉积到他克莫司晶体表面,制备他克莫司复合纳米晶的过程中既无其他有机试剂参与又在常温稳定的条件下,保证在制备的药物过程中对药物本身无影响。3.将人的角膜上皮细胞(HCEs)培养到生长期,考察各种条件下细胞对药物的摄取作用。考察载药的FK506-(PAH/CMC)_3纳米粒子,不同形态、不同尺寸对角膜上皮细胞吸收的影响。4.药物毒性实验培养人的角膜上皮细胞,待细胞完全贴壁后加入不同质量浓度(0.2、0.5、1、1.5、2mg/ml)的复合纳米颗粒FK506-(PAH/CMC)_3。两者共同孵育4小时后,加入CCK8检测液,测定各组的细胞活性率均与空白对照组比较。结果1.本实验通过两种不同的方法制备他克莫司纳米晶。超声法显示超声时间越长他克莫司晶的长径比越趋近于1,药物晶体接近于球形。但超声法制备的纳米晶均一性不如重结晶法制备的纳米晶优良。通过重结晶法可以得到针状和规则六边形等不同形态的他克莫司晶体。影响重结晶法制备的他克莫司纳米晶形成的因素包括:注射泵药物滴速、匀浆的转速、以及稳定剂的选择。2.通过LbL法对他克莫司纳米晶表面修饰,利用正负电荷之间的相互作用,将表面带正电荷的PAH与显负电荷的人工泪液逐层沉积于药物晶体表面。既可实现改善药物的亲疏水性、提高疏水药物溶解性,也实现了人工泪液对他克莫司免疫抑制剂的润滑功能修饰,起到联合给药作用,减少用药刺激并治疗中重度干眼的免疫炎症。3.通过染色不同尺寸的他克莫司纳米晶,发现尺寸较大的药物不易被细胞摄取。而且超声法制备的他克莫司微晶仍尚不均一,仍有一部分药物被阻拦在细胞外。反之重结晶方法优化出的纳米晶大部分被人角膜上皮细胞吸收,这也和药物的尺寸有关系。4.通过各个不同浓度的他克莫司复合纳米晶FK506-(PAH/CMC)_3,在人角膜上皮细胞上的细胞毒实验的分析。证明他克莫司复合纳米晶FK506-(PAH/CMC)_3对角膜上皮细胞基本没有毒性。结论超声法发现,超声时间越长他克莫司晶的长径比越趋近于1,药物晶体更接近于球形。但超声结晶法制备的纳米晶均一性不如重结晶法制备的纳米晶优良。重结晶法制备片状规则他克莫司纳米晶,重结晶法的注射泵滴速、匀浆的转速、以及稳定剂的选择都可以影响他克莫司纳米晶形态的形成。而且制备的他克莫司纳米晶与原料药对比晶型并未发生改变。他克莫司纳米药物表面成功修饰羧甲基纤维素钠人工泪液,二者起到润滑功能和免疫抑制的联合作用。细胞毒性实验说明,在临床药物浓度范围内,他克莫司对眼表没有毒性。角膜上皮细胞对尺寸较小的他克莫司纳米晶具有摄取作用。药物晶体的尺寸和形态可能对细胞摄取有影响。
【图文】：

衍射图谱,他克莫司,滴眼液,原料药

将原料药物粉末充分研磨，放入 X 射线衍射仪检测器中进行扫描，获得XRD 图谱。测定条件为常温，石墨单色器，扫描速度 6°/min，2θ扫描范围 3°~60°，，扫描间隔 0.02°电压 40 kV，电流 200 mA，λ（CuKa1）=1.5405 ，采用 CuKa1 辐射。以上数据采用 GraphPad Prism 5 对所得数据进行分析处理。1.1.9 数据处理及统计学分析由于纳米晶体的形状不属于球形，所以不能利用马尔文粒径分析仪测定。采用 nanomeasure 统计软件进行统计分析。1.2 结果1.2.1 超声法他克莫司的表征X 射线衍射，（X-ray diffraction，XRD）。通过（图 1a）分析他克莫司原料的衍射图谱，他克莫司的特征峰很尖锐，说明他克莫司具有良好的结晶性并且结晶度非常高。(图 1b)是已经上市在临床中使用的日本千寿生产的 0.1%他克莫司滴眼液药物，可以看到药物大小不均一，尺寸较大（16.1±4.2μm），表面有辅料覆盖。

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如（图2e）所示，较大尺寸的药物纳米晶被筛除后，剩余尺寸较小的他克莫司纳米晶，其分散性较为良好。图 2 在其他条件相同情况下，超声时间改变他克莫司晶体扫描电镜照片(a)0min；(b)12min；(c)24min；(d)32min；(e) 24min 后，800 目细胞筛筛选利用 Nanomeasure 软件统计发现，如（图 3a）所示，随着超声时间延长，纳米晶的粒径逐渐减小。但 24min 后，粒径的变化不再明显。（图 3b）显示随着超声时间的增加，药物的长径比(AR)逐渐降低且趋向于 1
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

【参考文献】