抗菌肽Domesticin和MnALF4在毕赤酵母中的表达及抑菌机制研究

发布时间：2020-06-13 19:35

【摘要】：抗生素的滥用引发细菌耐药性激增,严重威胁人类健康。因此,新型抗生素药物亟待开发。抗菌肽(Antimicrobial peptides)是一种短肽,是宿主先天性免疫防御病原体的第一道防线,具有广谱抑菌作用,有望成为传统抗生素的替代物。本研究利用毕赤酵母(Pichia pastoris)真核表达系统对家蝇(Musca domestica)抗菌肽Domesticin和日本沼虾(Macrobrachium nipponense)抗菌肽MnALF4进行了重组表达,并对两种抗菌肽的抑菌活性和抑菌机制进行了研究。首先构建了重组表达载体pPIC9K-domesticin和pPIC9K-MnALF4,分别将它们电击转化入KM71酵母感受态细胞中。甲醇诱导培养后利用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行检测,并用镍柱亲和层析对表达产物进行纯化。对纯化后的重组蛋白Domesticin和MnALF4分别进行抑菌和溶血活性检测;利用冷场发射扫描电子显微镜观察Domesticin和MnALF4对大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)形态的影响,以此研究Domesticin和MnALF4的抑菌机制。实验结果显示,Domesticin及MnALF4在毕赤酵母中成功表达,其大小分别为5.4 kD及12 kD。Domesticin及MnALF4对痢疾菌(Dysentery bacillus)等致病菌在内的22种细菌都有显著抑菌作用。扫描电镜观察到Domesticin可破坏细菌细胞膜,促使细菌皱缩溶解最终死亡;MnALF4可破坏细菌细胞壁,使杆状细菌变为球状的原生质体,进而溶解破碎导致细菌死亡,同时也可以破坏细菌细胞膜,使内容物外流从而杀死细菌。溶血活性实验表明Domesticin及MnALF4对动物细胞的溶血率低于2%。综上所述,Domesticin主要通过作用于细胞膜,改变细胞膜通透性使细胞完整性丧失,导致细菌死亡。MnALF4以细胞壁及细胞膜为共同靶点,发挥抑菌作用。Domesticin及MnALF4的广谱抑菌作用及低溶血率表明其有望成为新型抗菌剂。
【图文】：

电泳图,家蝇,基因,条带

蝇 domesticin 基因 PCR 子量；1：家蝇 domesticesis of Musca domestica do: Musca domestica domesti pMD-19T-domestic因与 pMD-19T 连接后隆，如图 3-2（A）所示条带出现，而以水为模克隆载体 pMD-19T-dopMD-19T-domesticin 经符，另一条带大小与 p

质粒,表达载体,基因,抗菌肽

T-domesticin 的菌落 PCR阳性克隆；11：阴性对in 质粒双酶切；2：pMDloned vector pMD-19T-doker ;1~10: positive clone;D-19T-domesticin plasmdomesticin 表达载体domesticin 基因及 p抗菌肽表达载体 pPI如图 3-3 所示，双酶切小与 domesticin 基因化质粒。将构建的表mesticin 基因与 pPIC
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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