SS31引导的盐酸米诺环素脂质体的设计与评价

发布时间：2020-06-14 11:09

【摘要】：氨基糖苷类抗生素引起的药物性耳聋已成为影响全世界人类健康的重要问题,临床上对其尚无行之有效的治疗策略,寻找一些药物来治疗药物性耳聋是当前研究的热点之一。药物性耳聋的关键环节是内耳毛细胞凋亡,传统治疗方法作用效果低,无法满足临床要求。为达到有效的药物治疗效果,本课题拟设计一种脂质体载药系统,装载水溶性药物盐酸米诺环素,利用多肽SS31(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)对脂质体(Lp)进行表面修饰,期望减小氨基糖苷类抗生素-庆大霉素造成的耳蜗毛细胞损伤从而达到治疗药物性耳聋的目的。处方前研究中,本文通过考察盐酸米诺环素在不同分散介质中紫外吸收光谱,选择等吸收点作为药物含量测定的最佳检测波长,进而建立盐酸米诺环素的体外分析方法。确定盐酸米诺环素在pH为4.36-6.00内的等吸收点为380 nm,pH为6.80-8.73内的等吸收点为358 nm;不同钙离子的HEPES-蔗糖(HBS)缓冲溶液中的等吸收点为357 nm;不同镁离子的HBS缓冲液中的等吸收点为350nm。盐酸米诺环素在不同pH条件下及甲醇溶液中的线性、精密度及回收率均符合要求。考察了盐酸米诺环素(MC)溶液的稳定性,结果显示,在pH 5.50-7.40的范围内,盐酸米诺环素的稳定性受pH、光照的影响不大,但随着温度的升高盐酸米诺环素降解速度加快。采用钙离子梯度主动载药法制备盐酸米诺环素脂质体,建立了Sephadex G-50微柱测定盐酸米诺环素脂质体包封率的方法。以包封率和载药量为参考指标,考察钙离子浓度、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、胆固醇含量、磷脂浓度、药脂比等处方因素及载药温度、载药时间等工艺因素的影响,最终确定盐酸米诺环素脂质体的最优处方为氢化大豆磷脂/胆固醇/磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(HSPC/Chol/DSPE-PEG2000)=70:24.4:5.6(molar ratio),水化介质钙离子浓度为120 mM,磷脂浓度为8.7 mg/ml,药脂比为1:10(Wt/Wt);载药温度为60℃,载药时间为15 min。该条件下Lp/MC包封率为97.8%,载药量为8.9%。采用点击化学方法(SS31-Cys和DSPE-PEG2000-MAL反应)进行修饰脂质体SS31-Lp/MC的制备,高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法确定SS31的连接率为82.3%±4.5%,SS31-Lp/MC包封率为93.4%,载药量为8.5%。最优处方脂质体Lp/MC及脂质体SS31-Lp/MC的粒径分别为143.5 nm及149.9 nm,Zeta电位分别为-35.0 mV和-25.8 mV;稳定性结果显示两种脂质体在4℃下避光放置8周,粒径、药物含量并未明显改变,表明SS31化后对脂质体的理化性质无明显的影响;以HBS缓冲液为介质,考察两种脂质体在不同pH及不同浓度牛血清蛋白(BSA)条件下的释放状态,结果表明pH及BSA浓度并未影响盐酸米诺环素的释放状态,同一条件下,脂质体SS31-Lp/MC明显比Lp/MC释放加快。建立斑马鱼实验动物模型,考察盐酸米诺环素、空白脂质体Lp和SS31-Lp及庆大霉素(GT)对斑马鱼侧线毛细胞的毒性作用,同时考察了盐酸米诺环素、空白修饰脂质体SS31-Lp、脂质体Lp/MC和SS31-Lp/MC预处理对毛细胞的保护作用;研究了脂质体对毛细胞力传导(MET)通道摄取及线粒体膜电位的影响。结果表明,盐酸米诺环素及庆大霉素对毛细胞的损伤存在剂量依赖型;两种空白脂质体对毛细胞无损伤作用;在慢毒作用模式下,SS31-Lp/MC对毛细胞的保护作用增强,DASPEI及DiOC2(3)两种评分结果均与庆大霉素毒性处理组存在显著性差异;脂质体并未影响毛细胞MET通道的功能,未减少庆大霉素的摄取。
【学位授予单位】：江西科技师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943
【图文】：

第 2 章 盐酸米诺环素脂质体的处方前研究.6.4 不同 pH 条件下光照影响实验取适量不同 pH 条件的样品溶液，分别置于棕色及透明细口瓶内，封口，置于干燥通风处，在 0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，48 h，72 h 取样应波长处测定吸光度，考察光照对稳定性的影响，每组平行三个样。3 实验结果.1 不同条件下检测波长的确定.1.1 以不同 pH 的 HBS 缓冲液为介质盐酸米诺环素在不同 pH 的 HBS 缓冲液中的 UV 吸收波谱。结果显示 为 4.36～6.00 时，其吸收波谱在 380 nm 存在等吸收点（见图 2-1）；在 p0～8.73 时，其吸收波谱在 358 nm 存在等吸收点（见图 2-2）。

图 2-2 盐酸米诺环素在 pH 为 6.80～8.73 的 HBS 缓冲液中的紫外吸收波谱Fig 2-2 The UV absorption spectrum of MC in HBS buffer at pH 6.80～8.73..1.2 以含钙离子的 HBS 缓冲液为介质盐酸米诺环素在含钙离子浓度的 HBS 缓冲液中吸收波谱如图 2-3 所示7 nm 存在等吸收点。

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本文编号：2712695