肿瘤细胞触发—激活式纳米药物递送系统的初步研究

发布时间：2020-06-15 19:43

【摘要】：肿瘤是威胁人类健康的严重疾病,迄今为止,化疗仍是恶性肿瘤的主要治疗方式,但传统的化疗药物靶向性差、毒副作用大、顺应性差、治疗效果不佳。近年来,纳米药物递送系统特别是响应型药物递送系统在一定程度上克服了化疗的弊端,而受到人们的普遍关注。但多数刺激响应型药物递送系统目前主要针对肿瘤微环境,如低pH、高谷胱甘肽(Glutathione,GSH),而炎症也具有类似的环境,因此缺乏肿瘤组织特异性。因此,为提高响应特异性,一些研究利用超声、光照等外源性刺激,响应治疗肿瘤,但因体外刺激的光和超声波在体内呈指数级别衰减,因此响应灵敏度有限。基于上述分析,如何构建出能够特异并灵敏地响应肿瘤细胞特异分子(肿瘤标志物)来实现肿瘤细胞内特异、灵敏的药物释放,实现肿瘤细胞激活治疗是响应型药物递送系统亟待解决的问题。基于此,本课题拟构建一种磁性复合纳米粒,通过肿瘤标志物响应性的修饰,将磁靶向性与灵敏响应肿瘤细胞的控释系统相结合,在肿瘤部位外加磁场作用下,可将药物快速递送至肿瘤组织并在肿瘤细胞内特异性释放药物,从而达到提高治疗效果,降低毒副作用的目的。该药物递送系统主要通过三方面来实现以上目标,1.介孔门控为肿瘤细胞激活响应治疗提供结构基础;2.DNA碱基互补及其识别目标分子后的构象变化特征为肿瘤细胞激活响应治疗提供“智能”感应门控;3.磁靶向特征为系统顺利、高效到达肿瘤组织奠定基础。氧化铁纳米粒(Iron Oxide Nanoparticles,IONPs)具有超顺磁性,磁响应能力强,可磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)等特点。介孔二氧化硅纳米粒(Mesoporous Silica Nanoparticles,MSNs)作为递送系统的药物储库具有诸多优点,如:比表面积大、生物相容性好、毒性低、孔径可调、表面易于修饰等。本课题首先通过化学共沉淀法合成IONP,再以IONP为核,通过溶胶-凝胶法制备核壳结构的复合磁性纳米粒(IONP@MSN,核:IONP,壳:MSN),随后对其表面进行叠氮官能团修饰(IONP@MSN-N3),利用其孔道装载广谱化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX),最终通过环加成反应在载药的IONP@MSN-N3表面连接可特异性识别肿瘤细胞标志物mi RNA-21且尾部有炔基修饰的发卡状DNA。该发卡状DNA不仅可以作为门控分子,避免DOX提前泄漏,而且该发卡状DNA的头部序列与miRNA-21完全互补,能够通过碱基互补配对与肿瘤细胞内mi RNA-21快速、高效识别并形成双链结构,导致发卡状DNA发生构象变化,由发卡状构象变为直链构象,孔道开启,实现高效、快速的药物释放。通过上述制备过程最终制备出具有肿瘤细胞特异触发-激活治疗能力的磁靶向药物递送系统IONP@MSN/DOX-DNA。本课题利用傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FT-IR)、X射线衍射测试(X-ray Diffraction,XRD)、能谱分析(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)等表征手段来证明IONP、IONP@MSN以及IONP@MSN-N_3的成功制备,傅里叶红外光谱(FT-IR)图和紫外全波长扫描图结果表明发卡状DNA成功连接在IONP@MSN-N_3表面,证明IONP@MSN-DNA的成功制备。透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)扫描图表明我们制备的IONP@MSN-N_3粒径大小约为150 nm,具有核壳结构。通过氮气吸附脱附实验,得到IONP@MSN-N_3纳米粒的比表面积为767.1698 m2/g,孔体积为1.03 cm~3/g,纳米粒子的平均孔道直径为3.04 nm,孔径大小适合药物装载。通过紫外可见分光光度法载药率的测定,证明纳米载体IONP@MSN-N_3成功并高效装载DOX,成功制备出IONP@MSN/DOX-DNA,载药率高达89.4%,并且在miRNA-21存在下,药物大量释放,48 h的释药率约为65.7%,而对照组48 h的释药率仅为11%。TEM扫描图表明其粒径大小约170 nm,而且磁性测试结果表明其具有较强的磁响应能力。本课题以人肝癌细胞(HepG2)为模型细胞,以人肝正常细胞(HL-7702)为对照细胞,考察肿瘤细胞激活式药物递送系统的体外抗肿瘤活性。RT-PCR对两种细胞的miRNA-21表达量进行检测,结果表明HepG2的miRNA-21表达量是HL-7702的3.57倍,具有显著差异。从激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)拍摄的8 h内相同量的IONP@MSN/DOX-DNA在两种细胞内DOX的释放结果发现,药物DOX仅在HepG2细胞中大量释放,在HL-7702细胞中释放较少,这说明肿瘤细胞高表达的miRNA-21具有激活DOX释放的能力。IONP@MSN/DOX-DNA(DOX:20μg/mL)对HepG2细胞和HL-7702细胞的24 h抑制率分别为68.7%和25.2%,凋亡率分别为58.5%和18.01%,表明该纳米系统的治疗具有显著的选择性。此外,随机序列DNA*(对miRNA-21无识别作用)堵孔的IONP@MSN/DOX-DNA*对两种细胞均无显著的杀伤作用,其对HepG2细胞的凋亡率为14.74%,对HL-7702细胞的凋亡率为12.2%。细胞实验结果表明制备的IONP@MSN/DOX-DNA具有肿瘤细胞激活治疗能力,降低对正常细胞的毒副作用。本课题以HepG2细胞荷瘤裸鼠为动物模型,考察肿瘤细胞激活式药物递送系统的体内抗肿瘤活性。通过活体成像技术考察IONP@MSN/IR783-DNA在裸鼠体内的分布情况,结果显示,与游离IR783组相比,IONP@MSN/IR783-DNA组增加IR783的体内循环时间,具有被动靶向作用,更重要的是在磁场的作用下,其具有显著的磁靶向能力。药效学结果显示,经过两周治疗,制剂IONP@MSN/DOX-DNA组对肿瘤的抑制率为72.4%,肿瘤部位给予外加磁场的IONP@MSN/DOX-DNA+MF组对肿瘤的抑制率为84.2%,而IONP@MSN/DOX-DNA*组无明显治疗作用,说明构建的肿瘤细胞激活式药物递送系统对肿瘤具有显著的治疗作用。病理学分析进一步证实了IONP@MSN/DOX-DNA具有良好的抗肿瘤效果,并显著降低DOX对正常组织的毒副作用。裸鼠磁共振成像结果显示,载体IONP@MSN-DNA具有良好的磁共振成像能力。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943
【图文】：

示意图,细胞的,示意图

6图 1.1 IONP@MSN/DOX-DNA 治疗肿瘤细胞的示意图Figure 1.1 Concepts of the tumor cell activated therapy using IONP@MSN/DOX-DNA

长扫描,全波,紫外,特征吸收峰

对 DOX 和发卡状 DNA 在 200~800 nm 范围内进行全波长扫描，结果如图2.1 所示。DOX 在 480 nm 处有个特征吸收峰，且无杂质峰干扰，在 240 nm 处虽然有最大吸收峰，但溶剂在此处的吸收容易产生干扰。发卡状 DNA 在 260 nm处有一个特征吸收峰，在 480 nm 处无吸收峰出现，不会对 DOX 的检测造成干扰，故可以选用 480 nm 作为 DOX 的紫外检测波长。

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