海藻酸铁纳米递药系统的构建及初步研究

发布时间：2020-06-16 09:34

【摘要】：肿瘤是威胁人类健康的严重疾病。传统的化疗由于缺乏特异性,对正常组织产生较大的毒副作用。纳米药物递送系统(Nano-drug delivery systems,NDDS)可通过高通透性和滞留(Enhanced permeability and retention,EPR)效应提高在肿瘤组织的分布,但依然存在递送效率低,释药不完全,无法实现深部肿瘤渗透等难题。因此,为了提高NDDS对肿瘤的靶向性,实现药物在肿瘤部位的响应性释放,并进一步将药物递送至深部肿瘤组织,本课题以具有良好生物相容性的天然多糖海藻酸钠(Sodium Alginate,Alg)为基体材料,六水合三氯化铁(FeCl_3·6H_2O)为交联剂,阿霉素(Doxorubicin,DOX)为模型药物,半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸(Cysteine-Arginine-Glycine-Aspartic acid-Lysine,CRGDK)五肽为靶分子,设计了一种肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)触发粒径转变型纳米制剂CRGDK-FeAlg/DOX。本课题通过简单的一步交联法合成了海藻酸铁(Iron-Alginate,FeAlg)纳米凝胶作为药物载体,并探究了不同合成条件对纳米凝胶粒径、形态的影响,确定了最佳合成工艺。为了使FeAlg纳米载体具有主动靶向性,我们通过碳二亚胺法将肿瘤靶向肽CRGDK接枝到Alg骨架上,再与FeCl_3?6H_2O交联形成CRGDK-FeAlg,将其用于荷载抗肿瘤药物DOX,得到最终纳米制剂CRGDK-FeAlg/DOX。CRGDK-FeAlg/DOX在TME弱酸性和还原性条件下,Fe~(3+)被还原为Fe~(2+),纳米凝胶自外向内解交联,粒径由大变小,一方面可以实现TME响应性药物释放,另一方面可以增强纳米制剂的深部肿瘤渗透作用。而且,释放的Fe~(2+)可以与肿瘤组织高浓度的H_2O_2反应产生·OH自由基,实现无O_2参与的肿瘤化学动力学-化疗联合治疗。体外研究结果表明CRGDK成功接枝到Alg骨架上,接枝率为14.68%。体外模拟TME条件下,FeAlg的粒径从50 nm降低至10 nm甚至更小,表明FeAlg可以在肿瘤部位实现粒径转变,这有利于纳米制剂向深部肿瘤渗透。CRGDK-FeAlg可以高效负载DOX,载药率和包封率分别为37.56%和40.12%。体外药物释放数据显示,CRGDK-FeAlg/DOX在pH为5.5,2mM谷胱甘肽(Glutathione,GSH)中72 h的累积释药百分率高达81.98%,相比单纯PBS组提高了49.69%,这为纳米制剂进入肿瘤细胞后精准释放药物,增强药物抗肿瘤效果,减少不良反应奠定了基础。细胞摄取结果表明,药物作用1 h时,细胞表面高度表达神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1,Nrp-1)受体的A549细胞对CRGDK-FeAlg/DOX的摄取量是FeAlg/DOX的2.87倍,这是由于CRGDK对Nrp-1受体具有高亲和力,从而介导更多的纳米制剂进入细胞,而细胞表面低表达Nrp-1受体的MCF-7细胞对不同制剂的摄取无明显差别。溶酶体共定位实验结果表明制剂入胞后可以有效实现溶酶体逃逸,随后DOX进入细胞核发挥抗肿瘤作用。体外活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测结果表明CRGDK-FeAlg可有效诱导ROS的生成。细胞凋亡结果表明,CRGDK-FeAlg/DOX(浓度5μg/mL)作用6 h的细胞凋亡率高达81.9%,是DOX组的1.7倍,表明CRGDK-FeAlg/DOX能高效诱导A549肿瘤细胞凋亡。Calcein-AM/PI活死细胞双染结果表明,CRGDK-FeAlg/DOX在0.6μg/mL的浓度下作用24 h时,细胞死亡百分率为65.93%,比DOX组提高了53.73%,这是因为CRGDK-FeAlg/DOX不仅具有主动靶向性,而且具有缓释效应,能在较长时间内保持较大浓度,DOX协同?OH发挥最佳的抗肿瘤效果。细胞抑制率实验结果表明,CRGDK-FeAlg/DOX(5μg/mL)作用48h对A549细胞的抑制率为75.26%,比游离DOX组提高了约36%。体外三维细胞球(Three-dimensional multicellular sphere,3DMCS)渗透实验结果表明,CRGDK-FeAlg/DOX可以有效实现深部肿瘤渗透,相较于粒径不变的SiO_2纳米粒,其渗透距离可增加大约60μm,这源于FeAlg的TME触发式粒径转变效应,从而将DOX递送至肿瘤深处,实现DOX在肿瘤组织的均匀分布,有利于其抗肿瘤效果的发挥。体内以A549荷瘤裸鼠为动物模型,小动物活体成像结果表明CRGDK-FeAlg/DOX可以实现在肿瘤部位的高效蓄积和长效滞留。肿瘤深部渗透结果表明CRGDK-FeAlg可以高效递送抗肿瘤药物DOX至肿瘤组织深部区域。肿瘤部位ROS产生结果表明,CRGDK-FeAlg能有效诱导肿瘤细胞产生ROS,效果优于FeAlg,可以与DOX协同发挥体内抗肿瘤效应。药效学实验结果显示,CRGDK-FeAlg/DOX可显著抑制体内肿瘤增殖,治疗结束的相对肿瘤体积(V/V_0)仅为1.13,明显低于空白对照组(V/V_0为4.79)。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943
【图文】：

第一章 前言海藻酸盐的交联是由 G 残基的羧酸盐基团与金属阳离子螯合引起的，即两个 G残基与一个金属离子以“蛋-盒”2:1 螺旋结构结合[36]，聚合物链之间的相互连接导致三维凝胶网络的形成，从而用于小分子药物、疫苗、多肽、siRNA 或者 DNA等的包封和可控递送[19]。基于此，我们拟构建一种基于天然多糖 Alg 的纳米凝胶，用于抗肿瘤药物的递送。

应进入肿瘤组织后，Doxil 大量滞留于肿瘤组织外围，造成药物在度分布不均一，治疗效率低[66]。降低的跨毛细血管压力差，升高压，以及细胞外基质的致密结构阻碍了纳米颗粒的扩散，极大地剂向肿瘤深部的渗透与均匀分布[67, 68]。将药物递送至整个肿瘤区效和良好预后的关键。克服肿瘤基质屏障，增加药物对实体瘤的强化疗效果的主要挑战之一[69, 70]。目前主要有两种策略可供探索合理调控纳米颗粒的理化性质，包括颗粒大小、形状和表面修饰肿瘤实质的能力，另一种策略是重塑 TME，包括肿瘤血管和基质环影响纳米颗粒深度穿透效率的一个重要参数[72-74]。大颗粒(100 n血管的高外渗及肿瘤组织蓄积，但由于在肿瘤基质中扩散障碍大深部肿瘤。相反，颗粒越小，扩散障碍越小，越有利于肿瘤的深部速度快，循环时间短，肿瘤蓄积有限[75]。因此，我们希望设计一 NDDS，该系统在循环过程中能够维持其初始大小，以允许较长的好的 EPR 渗漏效应，然后在肿瘤部位发生响应性粒径转换，从而的优点，增加肿瘤蓄积，促进深度穿透。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 许嘉弟;查宝兴;杨宁;王书友;陈惠英;鞠九龙;张苏玲;;CMMH对体外肿瘤细胞生长的影响[J];铁道医学;1987年03期

2 贾振庚;潘瑞芹;刘德辉;;多发性内分泌腺肿瘤[J];中日友好医院学报;1987年04期

3 胡丽萍;满延高;陈敏诲;;培养液中血清的含量对原代兔婴肾细胞生长的影响[J];解剖学杂志;1987年02期

4 ;肿瘤细胞比正常细胞生长快吗?[J];人民军医;1988年02期

5 ;药理学[J];中国医学文摘(基础医学);1988年06期

6 陈汉源;细胞的生长控制和肿瘤转化[J];第一军医大学学报;1988年01期

7 王健平,汤健;细胞生长抑制因子[J];生理科学;1988年S1期

8 徐世康,丁菲英,陈捷,蒋文美;罗丹明6GDN对人体肺瘤细胞的生物学效应[J];肿瘤;1988年06期

9 侯嵩生,李新明,尚廷兰,吴玉兰,李洪林;九连小蘖悬浮培养细胞生理生化研究 Ⅰ.细胞生长与培养液的电导率和过氧化物酶活性的变化[J];武汉植物学研究;1988年02期

10 赵雅丽,孟松娘,范保荣,林仲翔,王端顺,汪X仁;钙调素抑制剂——三氟拉嗪对肿瘤细胞增殖和微管组装的影响[J];实验生物学报;1988年04期

相关会议论文 前10条

1 吴涛;白海;王存邦;路继红;欧剑锋;;成人骨髓间充质干细胞对K562细胞生长的影响[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

2 路晓薇;冯崇锦;郭俊兵;罗冬元;;靶向Cdc6 RNAi抑制舌癌CAL-27细胞的增殖[A];中华口腔医学会全科口腔医学专业委员会第六次学术会议暨广东省口腔医学会全科口腔医学专委会2015年年会论文集[C];2015年

3 任俊丽;陶燕芳;杜薇薇;李之珩;李晓璐;徐利晓;肖佩芳;胡绍燕;潘健;卢俊;;存活素选择性抑制剂YM155可诱导SK-NEP-1肾母样肿瘤细胞的凋亡[A];第十三届江浙沪儿科学术会议暨2016年浙江省医学会儿科学学术年会论文汇编[C];2016年

4 廉建坡;林登强;祝宇;徐烈雨;徐云泽;;Ganetespib对pc12细胞的凋亡及血管内皮生长因子表达的影响[A];中国中西医结合学会泌尿外科专业委员会第十四次全国学术会议暨2016年广东省中西医结合学会泌尿外科专业委员会学术年会论文集[C];2016年

5 曲华;吴文周;安美文;滕维中;;基底加载时波形及应变幅度对细胞生长、增殖与铺展的影响[A];第七届全国生物力学学术会议论文集[C];2003年

6 廖琼;田静;韩杨;任霞;张之勇;姜国胜;廖琼;田静;韩杨;任霞;张之勇;姜国胜;;DBO对人慢性髓系白血病细胞K562的增殖、凋亡与自噬的影响[A];第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2017年

7 彭志宏;黄柏胜;文芳;韩仰;刘发益;邬力祥;;Mett19基因对U251细胞生长的影响及机制研究[A];湖南省生理科学会2013年度学术年会论文摘要汇编[C];2013年

8 王季石;罗青松;何颖颖;;血红素诱导HO-1基因的表达与K562细胞生长及凋亡关系的研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

9 谭瑶;邱志群;黄玉晶;王灵巧;舒为群;;微囊藻毒素暴露对PC12细胞的影响[A];2018环境与健康学术会议--精准环境健康：跨学科合作的挑战论文汇编[C];2018年

10 苏曙光;云径平;符珈;张梅芳;田秋红;;放线菌素D影响B23的磷酸化并抑制HepG2细胞生长[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 赵路;英科学家开发出培育成人干细胞新法[N];科学时报;2011年

2 纪十 科普作者 生命健康领域观察者;心脏能杀死癌细胞？[N];北京科技报;2017年

3 永诚;美发现控制细胞生长的蛋白质[N];中国医药报;2000年

4 吴志;肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞自动凋亡[N];中国医药报;2009年

5 ;细胞模型筛选抗SARS病毒药物试验技术要求[N];中国中医药报;2003年

6 记者 张孟军;加找到刺激干细胞生长分子[N];科技日报;2001年

7 记者 吴春燕 通讯员 宁习源 吴剑鹏;人类情绪可影响干细胞生长[N];光明日报;2014年

8 经天;控制细胞生长的蛋白质[N];中药事业报;2000年

9 中国青年报·中青在线记者 陈轶男;“T细胞杀手”养成记[N];中国青年报;2016年

10 本报记者 叶青 通讯员 卢文洁;细胞打印：筛选个性化肿瘤药物“新招”[N];科技日报;2019年

相关博士学位论文 前10条

1 邓圣泽;高级别胶质瘤细胞线粒体呼吸链活性状态关键调节蛋白的鉴定及临床意义研究[D];南方医科大学;2018年

2 卢佳;Girdin基因沉默对结直肠癌细胞恶性行为的抑制作用及其相关机制研究[D];吉林大学;2018年

3 康迪;形态发生过程中InR/Akt/TORC1信号通路负调控JAK/STAT活性从而参与细胞的命运决定[D];南京大学;2018年

4 杨静波;土贝母甲素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞的抑制作用及机制研究[D];吉林大学;2017年

5 王子梅;白细胞介素1β对AtT20细胞POMC基因表达调控的研究[D];中国协和医科大学;1998年

6 王永军;凋亡/增殖平衡失调在肺癌发生中作用的研究[D];中国协和医科大学;1997年

7 张媛媛;重组人岩藻糖基转移酶Ⅶ过表达对胚胎植入影响的实验研究[D];吉林大学;2007年

8 童煜;AcAPc2蛋白的纯化及其抗肿瘤作用机制的初步研究[D];四川大学;2007年

9 邹险峰;GPX和SOD协同作用模拟和新含硒肽的抗肿瘤作用[D];吉林大学;2007年

10 张双越;前列腺素E2合成通路在口腔癌发生过程中作用的研究[D];南京医科大学;2008年

相关硕士学位论文 前10条

1 陈俭娇;海藻酸铁纳米递药系统的构建及初步研究[D];郑州大学;2019年

2 张成晶;扶正解毒方调控M-CSF刺激下荷瘤小鼠TEMs细胞表达的机制研究[D];中国中医科学院;2018年

3 梁娟;HIV-1跨物种的鼠类细胞模型感染与病毒复制研究[D];桂林医学院;2018年

4 王艳;MEG3通过miR-125a-5p/TET2途径抑制HepG2细胞载脂蛋白（a）的表达[D];南华大学;2018年

5 唐辰晨;细胞膜表面ATP5B的表达对肿瘤细胞侵袭转移能力影响的研究[D];吉林大学;2018年

6 刘菊梅;双功能化核酸适体介导的催化茎环自组装技术检测肿瘤细胞的方法学研究[D];南方医科大学;2018年

7 单园;沉默Atg5对K562/ADM细胞阿霉素的化疗增敏作用[D];南华大学;2018年

8 鲁鑫;依鲁替尼及衍生物对肝癌细胞的增殖抑制作用及其机理研究[D];中国医科大学;2018年

9 姚贝;Nrf2介导NOX4过表达的NSCLC细胞氧化还原适应的研究[D];广东药科大学;2018年

10 曾纯;蓝光照射人RPE细胞过程中A2E的分布规律及其对胞浆内ROS浓度的影响[D];遵义医学院;2018年

本文编号：2715869