布罗佐喷钠抗脑缺血的分子调控靶点及作用机制

发布时间：2020-06-16 14:43

【摘要】：布罗佐喷钠[Sodium(±)-5-Bromo-2-(α-hydroxypentyl)benzoate,5-溴-2-(α-羟基戊基)]苯甲酸钠,商品名:Brozopine,BZP)是由郑州大学化学与分子工程学院在恩必普(1-3-n-Butylphthalide,NBP)的基础上经过结构修饰、构效关系评价、药理毒理研究、作用机制探讨等合成出来的,具有自主知识产权的新型化合物,目前已经进入了Ⅱ期临床阶段并取得良好的治疗效果。我们的前期研究已经充分证明了BZP对缺血性脑卒中有保护作用,但其药物作用靶点尚未阐明。因此本次课题我们拟从分子层面阐述BZP抗脑缺血的调控靶点及作用机制。通过清华大学生命科学学院的化学对接模拟,发现BZP与15-LOX-2的结合自由能相比于15-LOX-1更高,有更强的亲和性,故可能的靶蛋白中15-LOX-1被排除。离体实验证实BZP与15-LOX-2的抑制剂C8E4作用相似,推断BZP为15-LOX-2的抑制剂,而15-LOX-2可能为布罗佐喷钠抗脑缺血的调控靶点,为缺血脑损伤的修复提供了一种药物作用的新靶点和新的修复机制。第Ⅰ部分BZP对大鼠脑缺血后15-LOX-2代谢通路的影响目的:建立大鼠MCAO模型,观察BZP肠溶微丸对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用并探讨其对大鼠脑缺血后15-LOX-2代谢通路的影响。方法:MCAO模型的建立采用改良的Zea-longa线栓法建立MCAO模型。BZP肠溶微丸给药剂量的确定绘制BZP肠溶微丸的量效曲线,确定BZP肠溶微丸的给药剂量。分组与给药将SD雄性大鼠随机分为4组:Sham组;Model组;BZP肠溶微丸组;C8E4组。观察指标观察BZP肠溶微丸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用,包括病理改变(HE染色),神经行为学评分,脑梗死体积,脑水肿的变化;免疫组化检测15-LOX-2,用ELⅠSA试剂盒检测15-LOX-2代谢产物15-HETE、大鼠核因子κB亚基p65(NF-κB p65)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(ⅠL-6)、细胞间粘附分子1(ⅠCAM-1)的含量。结果:1.BZP肠溶微丸量效曲线的绘制根据BZP肠溶微丸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用的量效曲线,BZP肠溶微丸给药剂量(0.6,1.2,2.5,5.0,10,20 mg/kg)为横坐标,神经行为学评分、脑梗死体积、脑水肿为纵坐标绘制BZP肠溶微丸量效曲线。梗死体积是评价脑梗死的金指标,确定BZP肠溶微丸的最小有效量为1.2mg/kg,而20 mg/kg BZP肠溶微丸给药组与10mg/kg的BZP肠溶微丸给药组相比无显著差异,故10 mg/kg为BZP肠溶微丸的最大有效剂量,实验选择终剂量10 mg/kg的BZP肠溶微丸进行机制研究。2.组织形态学影响HE染色结果显示:Sham组组织结构清晰,细胞密集,排列整齐,细胞核居中,核仁清晰,细胞间隙致密无水肿。与Sham组相比,Model组梗塞侧的脑组织细胞体积缩小,胞质透亮,着色变浅,不均匀,细胞核固缩,核质比减小,出现许多空泡,细胞排列疏松紊乱,间隙变大,皮层、海马、纹状体坏死神经元占总神经元的比例分别为(60.98±9.29)%,(57.22±9.10)%,(41.11±6.43)%;与Model组相比,BZP肠溶微丸(1.2,2.5,5.0,10.0,20.0 mg/kg)组病理改变有不同程度的减轻,空泡明显减少,并呈现剂量依赖性;在皮层区,用药组各坏死神经元占总神经元的比例分别为(50.76±3.57)%,(39.31±4.96)%,(29.14±2.96)%,(19.31±4.51)%,(20.97±2.25)%;(P0.01,P0.05);在海马区,用药组各坏死神经元占总神经元的比例分别为(47.49±9.08)%,(36.29±7.85)%,(24.04±6.42)%,(15.03±2.40)%,(14.20±5.06)%;(P0.01,P0.05);在纹状体,用药组各坏死神经元占总神经元的比例分别为(34.57±7.09)%,(27.13±7.21)%,(19.02±5.73)%,(12.32±1.77)%,(12.66±3.87)%;(P0.01,P0.05)。而且等摩尔剂量的BZP肠溶微丸与C8E4组相比,BZP肠溶微丸组改善效果更明显。3.神经行为学评分、脑梗死体积、脑水肿体积的变化与Sham组相比,Model组动物行为学评分(神经行为缺失)较高,出现手术对侧肩内旋,前肢内收;推动双肩时,手术对侧抵抗力下降,行走绕圈,少数动物出现无自发活动,意识障碍,有较大的脑梗塞体积和严重的脑水肿(P0.01);与Model组相比,BZP肠溶微丸(1.2,2.5,5.0,10,20 mg/kg)组均可改善神经缺失症状,减小脑梗塞体积,减轻脑水肿,并呈现剂量依赖性(P0.05;P0.01),其中BZP(0.6mg/kg)组和等摩尔剂量C8E4(10mg/kg)组与Model组相比均无明显差异(P0.05)。BZP微丸(10mg/kg)组与C8E4(10mg/kg)组相比有显著差异(P0.01)。4.15-LOX-2的表达量免疫组化结果显示:与Sham组相比,Model组皮层,海马,纹状体三个区域15-LOX-2的表达量均显著升高(P0.01);与Model组相比,BZP(10mg/kg)肠溶微丸组与等摩尔剂量C8E4(10mg/kg)组15-LOX-2的表达量均显著减少(P0.01),其中10mg/kg的BZP肠溶微丸与等摩尔剂量C8E4组相比无显著差异(P0.05),说明BZP为15-LOX-2的抑制剂。5.15-HETE含量变化与Sham组(45.15±0.73 pg/ml)相比,Model组15-HETE的含量显著升高(93.94±0.49 pg/ml;P0.01);与Model组相比,BZP(10 mg/kg)肠溶微丸组可减少15-HETE的生成(56.67±1.2 pg/ml;P0.05),而等摩尔剂量C8E4(10mg/kg)组可明显降低15-HETE的含量(52.65±0.95 pg/ml;P0.01),其中10mg/kg的BZP肠溶微丸与等摩尔剂量C8E4组相比无显著差异(P0.05)。6.NF-κB p65含量的变化与Sham组(9.93±0.48 ng/mg)相比,Model组NF-κB的含量显著升高(61.03±0.82 ng/mg;P0.01);与Model组相比,BZP(10mg/kg)肠溶微丸组和等摩尔剂量的C8E4(10mg/kg)组均可显著降低NF-κB的含量(11.63±0.96ng/mg,22.89±0.35ng/mg;P0.01),其中10mg/kg的BZP肠溶微丸效果优于等摩尔剂量C8E4组(P0.05)。7.TNF-α含量变化与Sham组(10.52±0.14 ng/mg)相比,Model组TNF-α的含量显著升高(29.08±0.15 ng/mg;P0.01);与Model组相比,BZP(10mg/kg)肠溶微丸组可降低TNF-α的含量(12.2±0.71 ng/mg;P0.05),而等摩尔剂量C8E4(10mg/kg)组TNF-α的含量为21.87±1.17 ng/mg,其中10mg/kg的BZP肠溶微丸效果优于等摩尔剂量C8E4组(P0.05)。8.ⅠL-6含量变化与Sham组(15.33±0.17 ng/mg)相比,Model组ⅠL-6的含量升高(34.37±0.76 pg/mg;P0.05);与Model组相比,BZP(10mg/kg)肠溶微丸组可明显降低ⅠL-6的含量(17.87±0.97 ng/mg;P0.01),而等摩尔剂量C8E4(10mg/kg)组ⅠL-6的含量为27.95±1.1ng/mg,其中10mg/kg的BZP肠溶微丸效果优于等摩尔剂量C8E4组(P0.05)。9.ⅠCAM-1含量变化与Sham组(73.63±0.46 ng/mg)相比,Model组ⅠCAM-1的含量显著升高(147.1±1.29 ng/mg;P0.01);与Model组相比,BZP(10mg/kg)肠溶微丸组和等摩尔剂量C8E4(10mg/kg)组均可降低ⅠCAM-1的含量(97.36±0.52 ng/mg,116.6±0.22 ng/mg;P0.01,P0.05),其中10mg/kg的BZP肠溶微丸效果优于等摩尔剂量C8E4组(P0.05)。结论:BZP肠溶微丸对大鼠脑缺血再灌注损伤有预防作用,其机制通过抑制15-LOX-2的活性,进而抑制NF-κB,ⅠL-6,TNF-α和ⅠCAM-1炎症因子的表达,说明BZP为15-LOX-2的抑制剂,15-LOX-2可能为布罗佐喷钠抗脑缺血的调控靶点。第Ⅱ部分BZP对Na2S2O4诱导的PC12细胞缺氧损伤后15-LOX-2代谢通路的影响目的:探究布罗佐喷钠(Brozopine,BZP)对Na2S2O4诱导的PC12细胞损伤的预防作用机制,从而为临床应用提供相关依据。方法:OGD/R损伤模型的建立:采用含30mmol Na2S2O4的低糖培养基造成PC12细胞缺氧缺糖2h,然后换正常培养基复氧复糖24h,建立稳定的PC12细胞OGD/R损伤模型。分组与给药随机分为4组:Sham组;Model组;BZP组;C8E4组。BZP、C8E4组均需加入对应浓度的BZP、C8E4预处理24小时后,再进行OGD/R损伤处理。观察指标:观察BZP对Na2S2O4诱导的PC12细胞损伤的保护作用;用ELⅠSA试剂盒检测15-LOX-2代谢产物15-HETE、大鼠核因子κB亚基p65(NF-κB p65)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(ⅠL-6)、细胞间粘附分子1(ⅠCAM-1)的含量。结果:1.BZP量效关系曲线的确定与Control组相比,OGD/R损伤组的PC12细胞存活率明显降低(50.6%;P0.01);与OGD/R损伤组相比,经5、10、15、20、30、40μmol/L的BZP预处理的PC12细胞存活率均具有统计学差异(55.5%,61.7%,69.6%,77.8%,85.0%,81.3%;P0.05,P0.01);根据BZP对Na2S2O4诱导的PC12细胞损伤的保护作用的量效曲线,经40μmol/L BZP预处理的PC12细胞存活率与30μmol/L的BZP相比略有下降趋势,故30μmol/L为BZP的最高有效浓度。综上所述,实验选择终浓度30μmol/L的BZP作用于OGD/R处理的PC12细胞进行机制研究。阳性对照药C8E4按照与BZP等摩尔浓度计算得最终剂量30μmol/L,而C8E4(30μmol/L)组预处理的PC12细胞存活率为62.8%,BZP(30μmol/L)组与C8E4(30μmol/L)组相比有显著差异(P0.01)。2.细胞形态学的影响Control组神经细胞胞体较大,有较长的树突状突起,呈多角形或梭形;OGD/R损伤组神经细胞数量减少,胞体缩小,部分细胞无突起,部分神经细胞呈圆形;与OGD/R损伤组相比,经5、10、15、20、30、40μmol/L BZP、30μmol/L C8E4组处理后,可改善神经细胞的损伤,胞体较大,有树突状突起。而等摩尔浓度的BZP与C8E4组相比,改善效果更明显。3.15-HETE含量变化与Control组(39.13±1.2 pg/ml)相比,OGD/R损伤组15-HETE的含量显著升高(73.79±0.82 pg/ml;P0.01);与OGD/R损伤组相比,BZP(30μmol/L)组可明显减少15-HETE的生成(47.71±0.87 pg/ml;P0.01),而C8E4(30μmol/L)组也可降低15-HETE的含量(45.79±0.16 pg/ml;P0.05),其中30μmol/L的BZP与等摩尔剂量的C8E4组相比无显著差异(P0.05)。4.NF-κB p65含量的变化与Control组(84.79±0.91 pg/ml)相比,OGD/R损伤组NF-κB的含量显著升高(178.36±1.72 pg/ml;P0.01);与OGD/R损伤组相比,BZP(30μmol/L)组可显著降低NF-κB的含量(104.79±8.59 pg/ml;P0.01),而C8E4(30μmol/L)组也可降低NF-κB的含量(113.43±3.43 pg/ml;P0.05),其中30μmol/L的BZP与等摩尔浓度的C8E4组相比无差异(P0.05)。5.TNF-α含量变化与Control组(31.77±2.76 pg/ml)相比,OGD/R损伤组TNF-α的含量升高(94.82±1.03 pg/ml;P0.05);与OGD/R损伤组相比,BZP(30μmol/L)组可显著降低TNF-α的含量(33.68±1.99 pg/ml;P0.01),而C8E4(30μmol/L)组也可降低TNF-α的含量(76.18±1.67 pg/ml;P0.05),其中30μmol/L的BZP效果优于等摩尔浓度的C8E4组(P0.01)。6.ⅠL-6含量变化与Control组(33.08±1.06 pg/ml)相比,OGD/R损伤组ⅠL-6的含量升高(112.92±3.89 pg/ml;P0.05);与OGD/R损伤组相比,BZP(30μmol/L)组可降低ⅠL-6的含量(60.92±1.30 pg/ml;P0.05),而C8E4(30μmol/L)组ⅠL-6的含量为98.83±2.60 pg/ml,其中30μmol/L的BZP与等摩尔浓度的C8E4组相比有差异(P0.05)。7.ⅠCAM-1含量变化与Control组(45.07±9.39 pg/ml)相比,OGD/R损伤组ⅠCAM-1的含量显著升高(372.5±5.15 pg/ml;P0.01);与OGD/R损伤组相比,BZP(30μmol/L)组和C8E4(30μmol/L)组均可显著降低ⅠCAM-1的含量(83.64±4.55 pg/ml,213.29±2.42 pg/ml;P0.01),其中30μmol/L的BZP效果优于等摩尔浓度的C8E4组(P0.01)。结论:BZP对Na2S2O4诱导的PC12细胞损伤有预防作用,其机制通过抑制15-LOX-2代谢产物15-HETE的生成,进而抑制NF-κB,ⅠL-6,TNF-α和ⅠCAM-1炎症因子的表达,说明BZP为15-LOX-2的抑制剂,15-LOX-2可能为布罗佐喷钠抗脑缺血的调控靶点。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965

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