共载siRNA与紫杉醇胆固醇复合物的磷脂壳聚糖纳米粒用于姑息性瘤内注射抗肿瘤研究

发布时间：2020-06-16 19:55

【摘要】：姑息性瘤内注射治疗是针对全身一般状况差、肿瘤复发等无法手术治疗、或无法耐受全身化疗患者的一种治疗方法,目的是控制或缩小肿瘤体积,缓解由于肿瘤占位造成的呼吸困难、吞咽困难等并发症,减轻患者痛苦,提高生存质量,延长患者生存时间。姑息性瘤内注射治疗可用于治疗头颈部鳞状细胞癌、肺癌、食管癌、消化道肿瘤等。但是,目前临床上没有适合瘤内注射给药的化疗药物剂型,普通注射液肿瘤局部停留时间短,肿瘤细胞对药物摄取差,目前研究较多的温敏、pH敏感凝胶有注射压力大等问题。小分子化药与基因药物联用在癌症治疗中的协同作用是目前研究的热点,化药与基因药物双载的纳米系统可以改善药物耐药通道、提高细胞药物摄取量以增加化疗疗效,基因药物siRNA可以通过沉默肿瘤细胞特定基因,抑制肿瘤细胞增殖,起到协同抗肿瘤作用。双载纳米制剂一方面可以增加小分子化药溶解度,降低其毒副作用,另一方面保护siRNA不被血浆中的核酸酶降解,增加其细胞摄取量。基于以上目的,本课题设计制备一种磷脂壳聚纳米粒(LCS_NPs)同时负载紫杉醇胆固醇复合物(PTX-CH)及siRNA~(VEGF),一方面利用PTX-CH的抗肿瘤作用,另一方面siRNA~(VEGF)抑制肿瘤细胞VEGF蛋白的表达,减少鳞状细胞癌肿瘤组织中新生血管的生成,协同发挥抑制肿瘤的目的,用于头颈部鳞状细胞癌的姑息性瘤内注射治疗。首先,为了进一步增加PTX的亲脂性,以增加LCS_NPs的载药量,用溶剂蒸发法将PTX与胆固醇(CHO)制备成紫杉醇胆固醇复合物(PTX-CH),DSC、FTIR、X-射线粉末衍射检测确定其制备成功。其次,用乙醇滴入法制备紫杉醇胆固醇复合物磷脂壳聚糖纳米粒(PTX-CH-loaded LCS_NPs),在最佳处方及制备工艺条件下,纳米粒粒径为142.83±0.25nm,Zeta电位为13.5±0.2mV,包封率为92.83±0.29%。稳定性实验证明纳米粒3天内稳定性良好,满足体内外实验要求。药物体外释放研究表明,在偏酸性环境下药物可以更快的从纳米粒中释放出来,而肿瘤组织微环境呈酸性,纳米粒在肿瘤组织可以加速释放,有一定的靶向性。用4T1细胞对PTX-CH-loaded LCS_NPs进行体外抗肿瘤评价,激光共聚焦及流式细胞仪实验结果表明细胞对纳米粒的摄取速度及摄取量明显高于游离药物。细胞对纳米粒的摄取机制为高尔基体参与下有能量依赖性的穴样内陷内吞及巨胞饮。细胞凋亡实验表明,PTX-CH-loaded LCS_NPs可以诱导更多的肿瘤细胞发生凋亡。荷瘤小鼠体内实验表明,PTX-CH-loaded LCS_NPs瘤内注射治疗较PTX溶液能够更有效的抑制肿瘤生长并延长小鼠生存周期,可一定程度上抑制肿瘤细胞的远处转移。基于对PTX-CH-loaded LCS_NPs的研究基础,本研究选择靶向VEGF的siRNA——siRNA~(VEGF)为基因药物,涡旋法制备siRNA~(VEGF)/PTX-CH-loaded LCS_NPs,纳米粒的平均粒径为149.63±2.05nm,平均Zeta电位为10.70±0.30mV。凝胶阻滞实验结果表明PTX-CH-loaded LCS_NPs可以较好的固缩住siRNA~(VEGF),并保护siRNA~VEGFEGF 12h不被血浆中的核酸酶降解。用人鳞状细胞癌细胞CAL-27对siRNA~(VEGF)/PTX-CH-loaded LCS_NPs进行体外抗肿瘤评价,激光共聚焦及流式细胞仪实验结果表明LCS_NPs作为载体可以将siRNA有效的递送至细胞内部,Western Blot实验结果表明,LCS_NPs为载体的复合纳米粒能够有效的沉默CAL-27细胞中VEGF基因的表达,降低细胞中VEGF蛋白的表达量。siRNA~(VEGF)/PTX-CH-loaded LCS_NPs能够更有效的抑制CAL-27细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡。为了考察siRNA~(VEGF)/PTX-CH-loaded LCS_NPs瘤内注射给药体内抗肿瘤效果,本实验建立了Cal-27鳞状细胞癌荷瘤裸鼠模型,复合纳米粒瘤内注射后对肿瘤组织的抑制作用更强。肿瘤组织rtPCR及Western Blot实验结果表明siRNA~(VEGF)/Blank LCS_NPs组及siRNA~(VEGF)/PTX-CH-loaded LCS_NPs组中siRNA~(VEGF)mRNA相对表达量及siRNA~(VEGF)蛋白的表达较对照组明显降低。肿瘤组织切片TUNEL染色后可以观察到siRNA~(VEGF)/PTX-CH-loaded LCS_NPs组肿瘤中有更多的肿瘤细胞发生凋亡。表明复合纳米粒瘤内注射给药后抗肿瘤效果更强,明显优于普通的PTX注射液。本研究结果表明LCS_NPs可以作为PTX及siRNA双载的载体,siRNA~(VEGF)/PTX-CH-loaded LCS_NPs用于头颈部鳞状细胞癌肿瘤姑息性瘤内注射治疗时,可以更有效的抑制肿瘤细胞生长,降低肿瘤细胞VEGF蛋白的表达。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943

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本文编号：2716502