共生曲霉菌D来源的聚酮类化合物及其生物合成初探

发布时间：2020-06-18 19:21

【摘要】：海洋是一个低温、高压、高盐等复杂而又特殊的环境,海洋微生物生存于这样的环境中逐步衍生出与陆地生物不同的遗传基因和代谢机制,造就了其独特的代谢和防御系统。海洋微生物与海洋海藻、无脊椎动物共附生是一种很普遍的现象,共附生微生物更能产生结构新颖、活性多样的新颖天然产物。海洋共生曲霉菌是近年来研究最为广泛的海洋真菌,其次级代谢产物具有广泛的化学多样性和生物活性,是筛选药物先导化合物的重要来源之一。曲霉菌次级代谢产物是在一系列相关酶连续作用下逐步生成的,这一系列的酶促反应组成了代谢途径,对曲霉菌次级代谢产物生物合成途径进行深入研究有利于探究其代谢机理和提高产物产量。论文以滨海植物结香(Edgeworthia chrysantha Lindl.)来源的一株共生曲霉菌D为研究对象,系统开展了次级代谢产物生物合成基因簇分析、次级代谢产物分离与鉴定、生物活性评价及聚酮类产物生物合成的研究。曲霉菌D经马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)培养、固体大米规模发酵、乙酸乙酯(EtOAc)超声萃取后得到粗提物I。采用现代色谱技术(pre-HPLC、semiprep-HPLC等),对粗提物I进行系统的分离,共得到了8个单体化合物(1 8),利用现代波谱技术(NMR、MS等)并查阅相关文献数据,鉴定了8个聚酮类单体化合物分别为:rubrofusarin B(1),alternariol 9-O-methyl ether(2),fonsecinone D(3),asperpyrone A(4),asperpyrone D(5),fonsecinone B(6),fonsecinone A(7)和aurasperone A(8)。抑菌活性研究结果表明,化合物1-8对大肠杆菌(Escherichia coli AB 94012)、白色念珠菌(Candida albicans AY 204006)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus AB 2010021)的抑制作用较弱,MIC值均高于100μg·mL~(-1);仅化合物8对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)有一定的抑制能力,其MIC值为50μg·mL~(-1)。微生物全基因组测序与结果分析,表明曲霉菌D具有代谢丰富次级代谢产物的能力。通过antiSMASH预测菌D中包含11个合成PKS关键基因簇,对其基因簇进行产物结构预测发现菌D具有代谢betaenone类、equisetin类及alternapyrone类化合物的功能。分子生物学分析结果表明基因scaffold8.t287可能参与调控合成聚酮类化合物,经抗性标记筛选、重组载体构建、根瘤农杆菌转化等实验后敲除该目的基因,采用PCR验证并测序后成功得到敲除菌株?HY44,在相同条件下发酵菌?HY44得到粗提物II,经HPLC制备分离,结合~1H NMR、UPLC技术发现敲除菌株?HY44的代谢产物种类和含量均发生了改变,表明该基因确实参与调控聚酮类化合物的生物合成。
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914
【图文】：

生物合成途径,化合物

图 1-1 Notoamide E4 的生物合成途径推测Figure 1-1. Plausible biosynthetic pathway of notoamide E41.1.2 曲霉 Aspergillus allahabadii 的研究概述一株香桂来源的植物内生真菌 Aspergillus allahabadii BCC45335[3]，经 PDB 发酵后，分离得到 2 个新化合物 allahabadolactones A(1.22) 和 B (1.23)，以及 3 个已知的化合物（1.24 1.26）。而后，对化合物 1.22 和 1.23 的生物活性及生物合成途径进行了研究，如图 1-2。活性实验表明，化合物 1.22 1.23 对 Vero 和 NCI-H187 细胞株均有一定细胞毒活性，其 IC50值范围大约为 0.58-30.51 μg·mL-1。1.22 1.23

生物合成途径,化合物

图 1-2 化合物 1.22 1.23 生物合成途径推测Figure 1-2. Plausible biosynthetic pathway of compounds 1.22 1.23.3 曲霉 Aspergillus europaeus 的研究概述查阅文献资料报道，大都研究者对曲霉菌来源的次级代谢产物进行抗菌抗肿评价，而关于抗氧化方面的研究较少。现有一株海绵 Xestospongia testudinaria 曲霉菌 Aspergillus europaeus WZXY-SX-4-1[4]，基于 OSMAC 策略，对该菌分别、MnPY、ISP2、PDB 液体培养基，及加海盐的固体大米培养基发酵，经 EtOA萃取、初步 DPPH 活性实验后表明大米发酵得到的粗提物有显著的清除自由基活终确定选择大米作为培养基。结合硅胶柱和 HPLC 分离，分离得到六个新聚酮物，分别为 eurobenzophenones A-C (1.27 1.29)，euroxanthones A-B (1.30 1.31)，及O-demethylvariecolorquinones A(1.32)，化合物 1.29 对于清除 DPPH 具有较好的活合物 1.28 对于 DPPH 的清除有微弱活性，相应的 IC50值分别为 1.70 和 18.5 μg·m 96 孔板 NO 抑制实验证明，所有化合物均有对小鼠格子细胞 BV2 抑制作用及人肠癌细胞株 SW480 中 NF-κB 激活作用，从而抑制 LPS 诱导一氧化氮（NO）产

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