肉毒素轻链LC和TAT-EGFP-HCS的表达和生物学功能研究

发布时间：2020-06-26 03:31

【摘要】：目的:神经母细胞瘤是儿童中最常见的实体瘤,并且在患有远处转移和/或MYCN癌基因扩增的患者中是高度恶性的,超过12个月。由于其特定的位置,神经元肿瘤在手术后复发率很高,因此死亡率极高,并且发病率也很高。目前,用于治疗神经内膜肿瘤的药物靶向性差,难以获得所需的治疗效果,并且药物本身也具有高的不良副作用发生率。因此,开发一种用于治疗神经肿瘤的低毒,高效的靶向药物是一项紧迫的任务。肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是由厌氧梭菌肉毒杆菌产生的外毒素,具有7种血清型的A-G(3)。BoNT的结构和功能结构域非常保守,其前体是分子量约150KD的单一多肽链。前体被内源或外源蛋白水解酶分解成通过两个硫键连接的活性双链结构:轻链(LC,50KD)是具有内肽酶活性的催化结构域;重链(HC,100KD)是一种细胞结合和易位结构域,可以介导细胞膜上特定受体和神经毒素之间的结合。据文献报道,肉毒杆菌毒素可抑制人神经肌肉接头处神经递质乙酰胆碱的释放,导致一系列弛缓性麻痹症状。此外,肉毒杆菌毒素可以阻断神经和肌肉之间的“信息传递”,使过度收缩的肌肉松弛,皱纹消失,在美容上应用很广泛。虽然肉毒杆菌毒素在治疗中枢性疾病中有许多应用,但作为生物大分子,很难通过血脑屏障,这极大地限制了它们的应用。许多神经系统疾病都位于中枢神经系统内,要想使其所携带的药物进入神经其系统必须要解决如何通过血脑屏障的问题。虽然肉毒素作为神经系统疾病的靶向载体已有报道,但是有很多的毒副作用。最近的研究表明,TAT肽融合蛋白可通过外周血通过血脑屏障进入大脑。TAT肽是由HIV Tat蛋白的转导结构域的11个氨基酸残基组成。与传统的脑内注射相比,TAT介导的蛋白质转导技术可以将生物大分子递送到大脑,而不会引起脑组织的感染和创伤。迄今已报道了许多TAT融合蛋白,例如TAT-14-3-3?,TAT-Bcl-xL,TAT-球蛋白和TATPARK7。它们能够有效地穿过BBB并在脑疾病的动物模型中显示出显着的神经保护作用。本研究构建了pET-28a-TAT-EGFP-HCS和pET-28a-TAT-EGFP-LC质粒,并表达纯化,验证了生物活性;用蛋白EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-LC、TAT-EGFP-HCS与PC12细胞、BV2细胞、C6细胞和HeLa细胞共孵育实验,验证了TAT-EGFP-LC是否可以这些细胞的细胞膜以及穿膜能力的比较;验证了蛋白TAT-EGFP-HCS在小鼠体内对于心脑肝肾组织穿膜能力。研究方法:1.TAT-EGFP-HCS、SNAP-25、LC和TAT-EGFP-LC的质粒构建、表达、检测和活性测定对质粒进行双酶切,将酶切后的pET-28aTAT-EGFP和HCS进行连接,然后进行转化实验,转化到DH5a感受态细胞中进行挑单克隆扩增细菌,扩增、双酶切反应,电泳鉴定。将连接后质粒pET-28aTAT-EGFP-HCS进行转化,挑单克隆进行扩增培养,继续扩增培养,然后进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot;电泳和Western-Blot验证后进行蛋白纯化实验,大量表达后,收集细菌,进行蛋白纯化,用HIS标签蛋白纯化柱对其进行纯化,纯化后用透析袋对蛋白进行盐析,之后进行保存;按照同样的方法构建质粒pET-28a-TAT-EGFP-LC、pET-28a-LC和pET-28a-SNAP-25,然后进行表达纯化,得到蛋白后进行LC、TAT-EGFP-LC酶切SNAP-25活力测定,以购买的肉毒素酶切SNAP-25作为对照,然后进行SDS-PAGE电泳,Western-Blot鉴定,利用SNAP-25抗体进行特异性检测,验证蛋白LC、TAT-EGFP-LC的酶切活力。培养PC12细胞,加入蛋白LC和TAT-EGFP-LC与细胞共同孵育,提取蛋白液体,进行Western-Blot鉴定,检验蛋白LC是否可以穿过细胞膜,是否能发挥酶作用切开PC12细胞中的SNAP-25。2.蛋白EGFP、TAT-EGFP-HCS、TAT-EGGP-LC、TAT-EGFP对PC12,BV2,C6以及Hela细胞的穿膜能力分别培养PC12细胞、BV2细胞、C6细胞和HeLa细胞,待细胞长好后传代于六孔板中,然后进行蛋白EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-HCS和TAT-EGFP-LC与细胞共孵育实验,加入新鲜培养液,荧光显微镜照相,观察EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-HCS和TAT-EGFP-LC穿膜情况,用流式细胞仪再次分析穿膜的结果3.蛋白EGFP、TAT-EGFP-HCS、TAT-EGGP-LC、TAT-EGFP对PC12细胞的凋亡的影响用蛋白TAT-EGFP-HCS、TAT-EGFP、EGFP、TAT-EGFP-LC与PC12细胞共同孵育,收集样品,进行流式细胞仪检测,验证这几种蛋白对PC12细胞是否可能引起细胞凋亡。4.蛋白TAT-EGFP-HCS在小鼠组织中的分布将蛋白TAT-EGFP-HCS进行C57BL/6小鼠尾静脉体内注射,取小鼠组织心脑肝肾,制备成冰冻切片,用荧光显微镜观察蛋白对组织穿膜情况。结果:1.成功构建了质粒ET-28a-TAT-EGFP-HCS、pET-28a-SNAP-25、pET-28a-TAT-EGFP-LC、pET-28a-LC,经过表达后SDS-PAGE电泳鉴定,与理论值一致,说明表达成功,并且证明蛋白SNAP-25、TAT-EGFP-HC、LC和TAT-EGFP-LC在体外具有很好的生物活性;2.通过蛋白EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-HCS、TAT-EGFP-LC与细胞共孵育实验,荧光显微镜观察发现TAT-EGFP-HCS对神经细胞PC12细胞、BV2细胞、C6细胞和HeLa细胞穿膜作用相对较强,而TAT-EGFP-LC穿膜能力较弱并且EGFP蛋白并无细胞穿膜能力,证实TAT-EGFP-HCS具有特异性的细胞穿膜作用;经过流式细胞仪检测,得到类似的结果。3.蛋白TAT-EGFP-HCS、TAT-EGFP、EGFP、TAT-EGFP-LC与PC12细胞共同孵育后,用流式细胞术测得蛋白TAT-EGFP-LC可以引起PC12细胞的早期凋亡,而蛋白EGFP,TAT-EGFP,TAT-EGFP-HCS对细胞的凋亡情况没有影响。4.分别比较将TAT-EGFP-HCS蛋白尾静脉注射小鼠后脑肝心肾的分布情况,发现TAT-EGFP-HCS对小鼠脑组织穿透能力较强,对其他组织穿透能力明显弱于脑组织。结论:1.蛋白EGFP、TAT-EGFP、TAT-EGFP-HCS在体外表达的生物学活性,未看到明显的细胞毒副作用,与细胞共同孵育后,细胞依然生长良好,而蛋白TAT-EGFP-LC可引起细胞凋亡;2.体外实验显示,TAT-EGFP-HCS具有特异性的穿透神经细胞的作用,并且穿透能力强于TAT-EGFP,而TAT-EGFP-LC的穿膜能力较差;在非神经细胞HeLa细胞中穿膜能力弱于TAT-EGFP;3.表达的肉毒素重链TAT-EGFP-HCS具有明显的神经导向作用蛋白,在小鼠体内蛋白TAT-EGFP-HCS具有特异性的穿透血脑屏障作用,能进入小鼠大脑。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91
【图文】：

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图 1.1 显微镜下观察到的肉毒杆菌示意图肉毒素毒性最大的片段由 50KD 的轻链（氨基酸序列为 1-448）和 100KD 的（氨基酸序列为 449-1296）构成，轻链和重链通过二硫键（C430-C454）连接[42]。图 1.2 肉毒素结构示意图肉毒素和神经细胞的识别是通过肉毒素重链的羧基端(HCc)和神经细胞膜上经节苷脂受体和 synaptotamin 蛋白受体实现的。文献调研显示真正起识别和结用的是 HCc 的第 1080 至 1291 氨基酸这个区域（如下图绿色部分）。图中黑框部分为 HCc 和神经细胞的神经节苷脂受体结合域的二级结构，其中绿色的氨基

结构示意图,神经细胞,氨基,受体

3图 1.2 肉毒素结构示意图肉毒素和神经细胞的识别是通过肉毒素重链的羧基端(HCc)和神经细胞膜上神经节苷脂受体和 synaptotamin 蛋白受体实现的。文献调研显示真正起识别和结作用的是 HCc 的第 1080 至 1291 氨基酸这个区域（如下图绿色部分）。图中黑框的部分为 HCc 和神经细胞的神经节苷脂受体结合域的二级结构，其中绿色的氨基是参与识别的氨基酸，也是我们要进行定点突变的位点。这些位点分别是：1）于 1266 位的色氨酸（W）取代其吲哚基；2）1267 位的酪氨酸（Y）取代其苯环3）1253 位的组氨酸（H）取代其咪唑基；4）1203 位的谷氨酸(E)变成中性氨基或碱性氨基酸；5）1264 位的丝氨酸（S）消除羟基改变极性。通过这样一系列的变，来确定 HCc 中的不同特性的残基对肉毒素结合结构域的作用的提高程度，确肉毒素对神经细胞亲合力最强的结合结构域[43-45]。

【参考文献】