基于S6K1靶点的抗2型糖尿病和抗肥胖的药物作用机理研究

发布时间：2020-06-29 22:22

【摘要】：糖尿病是人类最重要的一种慢性代谢性疾病。生活水平的提高和生活方式的改变导致的营养过剩和运动缺乏是诱发2型糖尿病和肥胖的最重要因素。微血管和大血管循环障碍带来的糖尿病综合症是糖尿病发病和死亡的主要原因。病理生理学研究发现糖尿病的发生主要是由于胰岛素分泌不足和受体敏感性下降,即胰岛素抵抗。在正常情况下,胰岛素结合至胰岛素受体能够激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)信号通路。该通路中的一个关键性激酶是AKT,激活AKT能够促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)从细胞浆转移至细胞膜上,从而增加葡萄糖吸收。另外,AKT能促进进入细胞内的葡萄糖合成为糖原;AKT同时还能抑制肝细胞内的糖异生从而减少葡萄糖释放。在胰岛素抵抗的情况下,胰岛素刺激其受体的敏感性下降,导致AKT的磷酸化水平增加不明显,AKT活化能力不足,调控血糖水平能力下降从而导致血糖升高,即糖尿病。S6K1(p70 S6激酶)是PI-3K通路中的一个重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,该酶在营养过剩的情况下持续性过度激活,显著降低胰岛素受体的敏感性,诱发2型糖尿病和肥胖。S6K1下游的一个重要底物是胰岛素受体底物(IRS-1)。S6K1磷酸化IRS-1的S1101位点,降低IRS-1的稳定性,抑制IRS-1与磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)的p85亚单位的结合。抑制S6K1活性会反馈性激活PI-3K信号通路,增加葡萄糖吸收。S6K1在糖尿病的发病机理中发挥重要的作用,S6K1抑制剂可增加胰岛素受体的敏感性从而增加葡萄糖吸收并降低血糖水平。S6K1在肥胖的发病机理中也起着非常重要的作用。S6K1基因缺陷型的小鼠能够抵抗高脂肪饲料诱导的肥胖和2型糖尿病。一方面主要是由于S6K]参与脂肪干细胞的分化;另一方面,近年来研究发现在肿瘤细胞和神经元细胞中,S6K1抑制剂抑制S6K1活性后,导致AMPK激活进而诱导自噬。在脂肪细胞中,含脂滴的自噬小体与溶酶体融合后将对甘油三酯进行降解。鉴于此,我们推测S6K1抑制剂可能会抑制脂肪细胞的分化并通过诱导自噬促进脂滴的降解。近来研究发现抗类风湿性关节炎(RA)药物来氟米特(leflunomide)及其活性代谢产物A77 1726能抑制S6K1活性。由于来氟米特是一个人工合成的化合物,本研究拟从植物抽提的化合物中遴选出一个S6K1抑制剂并研究其是否具有调控血糖的效果。我们对发表的文献进行搜索,发现生姜提取物姜烯酮A(GinA)是一个S6K1抑制剂。本研究以2型糖尿病小鼠模型、肌管细胞和脂肪细胞为研究对象,使用这两个S6K1抑制剂,通过蛋白免疫印迹、免疫共沉淀、免疫荧光、葡萄糖耐受试验(GTT)和胰岛素耐受试验(ITT)等技术手段,揭示S6K1抑制剂对2型糖尿病和肥胖中关键信号蛋白和功能的影响,以期阐明S6K1抑制剂治疗2型糖尿病和肥胖的临床前药效及其分子机制,为抗糖尿病和抗肥胖药物的研发提供理论依据和新思路。具体研究分为以下三个部分:1.来氟米特的降血糖作用及其机理研究为研究来氟米特对2型糖尿病小鼠的降血糖作用及其分子机制,我们在体外试验中以3T3-LI脂肪细胞、C2C12和L6肌管细胞为细胞模型,用来氟米特的活性代谢产物A77 1726处理细胞,运用蛋白免疫印迹检测胰岛素信号通路和PI-3K通路相关蛋白的磷酸化水平;运用免疫共沉淀检测PI-3激酶的p85亚基与IRS-1的结合;运用免疫荧光检测GLUT4的移位情况,同时运用同位素示踪检测葡萄糖的吸收情况。在体内试验中我们建立了高脂肪饮食(HFD)诱导的2型糖尿病小鼠模型,并且应用了 ob/ob小鼠,在来氟米特灌胃3d后,检测小鼠血糖水平并分别进行GTT和ITT测定,同时检测ob/ob小鼠体内AKT的磷酸化水平。结果表明,A77 1726能增加AKTS473/T308和S6KIT389的磷酸化水平,并降低S6S235/236和IRS-IS1101的磷酸化水平。A77 1726能增加胰岛素受体的酪氨酸磷酸化水平以及PI-3激酶p85亚基与IRS-1的结合。在L6细胞中,A77 1726能增强胰岛素刺激的GLUT4转移至细胞膜上。在L6肌管细胞和3T3-L1脂肪细胞中,A77 1726能增强胰岛素刺激的葡萄糖吸收。ob/ob和HFD饲喂的小鼠口服灌胃来氟米特后,小鼠血糖恢复到正常水平并能克服GTT和ITT中的胰岛素抵抗,且对正常饮食饲喂的小鼠没有影响。来氟米特能增加ob/ob小鼠脂肪和肌肉中AKTS473/T308的磷酸化水平,但对正常小鼠无影响。本研究表明来氟米特通过抑制S6K1活性来致敏胰岛素受体,并且来氟米特对于治疗同时患有RA和糖尿病的患者具有潜在的意义。2.Gin A通过抑制S6K1致敏胰岛素受体并增加葡萄糖吸收为阐明Gin A对葡萄糖吸收的作用及其分子机制,我们以3T3-L1脂肪细胞和L6肌管细胞为细胞模型,用GinA处理细胞,通过蛋白免疫印迹检测信号通路相关蛋白的磷酸化水平,用免疫共沉淀检测PI-3激酶的p85亚基与IRS-1的结合;运用免疫荧光检测GLUT4的移位情况,同时用2-NBDG化学发光法检测葡萄糖的吸收情况。蛋白免疫印迹结果显示,Gin A能增加AKTS473和S6KIT389的磷酸化水平并降低S6S235/236和IRS-1S1101的磷酸化水平,表明Gin A能反馈性激活PI-3激酶。蛋白免疫印迹和免疫共沉淀结果显示,Gin A能增加胰岛素受体的酪氨酸磷酸化以及PI3K的p85亚基与IRS-1的结合。免疫荧光试验结果表明,Gin A能增强胰岛素诱导的GLUT4移位至细胞膜上。2-NBDG荧光测定结果显示Gin A能增强3T3-L1脂肪细胞和L6肌管细胞中胰岛素刺激的葡萄糖吸收。本研究表明,Gin A通过抑制S6K1致敏胰岛素受体并增加体外葡萄糖吸收。Gin A对糖尿病有潜在的治疗作用。3.来氟米特以自噬-溶酶体途径促进脂质代谢为揭示来氟米特对脂质代谢的作用及其作用机理,我们在体外以3T3-L1脂肪细胞为细胞模型,用来氟米特的活性代谢产物A77 1726处理细胞,运用蛋白免疫印迹检测自噬相关蛋白的表达水平以及AMPK信号通路蛋白的磷酸化水平;运用免疫荧光检测自噬小体与溶酶体、自噬小体与脂滴的共定位情况;同时运用脂滴油红染色检测脂滴降解情况。蛋白免疫印迹结果显示,A77 1726能显著增加自噬标志物LC3 II的表达,并以时间和剂量依赖方式增加AMPKT172和ULKS555的磷酸化水平。通过Bafilomycin阻断自噬小体和溶酶体结合、GFP-RFP-LC3双荧光标记以及自噬小体和溶酶体的共定位试验,表明A77 1726能激活AMPK并诱导完全自噬。脂滴油红染色和自噬小体与脂滴共定位试验结果表明,A771726介导的自噬通过溶酶体降解脂滴。本研究表明,A77 1726通过激活3T3-L1脂肪细胞AMPK并以自噬-溶酶体途径调节脂质代谢。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965

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