人血浆中抗癫痫药物及维生素浓度检测方法的建立及其在癫痫患者中的应用

发布时间：2020-07-12 05:33

【摘要】：第一部分:抗癫痫药物新方法的开发与验证卡马西平背景:卡马西平复杂的药代动力学特征导致血浆浓度个体差异较大,需要常规监测其药物浓度,以确保其有效性、安全性并减少不良反应的发生。目的:本研究旨在建立并验证一种更简便、快速、准确、灵敏、经济有效、新颖的液相色谱质谱联用(LC/MS)检测方法以提供快速,准确和可靠的卡马西平血浆药物浓度检测结果。方法:为此测定方法选择的流动相是乙酸铵(5mM),甲醇(40:60v/v)。使用安捷伦LC/MS系统。为了分离分析物,选择了 Diamonsi1 C18柱(150mmX 4.6mm,5μm)。103份血样本均来自山东大学齐鲁医院接受卡马西平常规治疗的癫痫患者,采用LC/MS分析方法测定卡马西平血浆浓度。选择简单的蛋白质沉淀方法提取分析物。结果:线性方程为y = 2.44516x + 0.00348175,相关系数(R2)为0.99881,线性范围为5-1000ng/ml。结果显示,所有进行的分析验证参数均在国际协调指导原则的公认范围内。结论:一种简单,快速,准确,灵敏,经济有效,新颖和精确的LC/MS方法得以开发和发展,其具有简单的提取过程,较少的血浆体积和较低的定量限,可用于103例癫痫患者的卡马西平的药物监测。该测定技术也可用于其他临床应用,如药代动力学,毒代动力学和生物等效性研究。苯妥英钠背景:苯妥英钠具有治疗窗窄和非线性药代动力学特征,吸收不规则,剂量与浓度不可预测,同时由于多种药物同时应用存在的显著的药物相互作用,常规的血药浓度监测对于癫痫患者的个体化治疗和维持治疗尤为重要。苯妥英钠血浓度监测很难同时做到简单、快速、精确、易行、经济、高效且灵敏,目前所用检测方法耗时、复杂而且昂贵,另一方面,简便、快速且经济的分析方法又难以兼顾准确度和灵敏度。医生和患者需要等待很长时间才能获得可靠的苯妥英钠浓度监测数据,用于临床决策。而合理且及时的治疗决策对于癫痫患者至关重要。目的:本研究旨在建立并验证一种快速简便、准确、高度灵敏、经济易行的液相色谱-质谱联用检测方法,以提供快速,准确和可靠的苯妥英药物浓度结果。方法:使用安捷伦LC/MS系统。流动相的混合物是乙酸铵(5Mm):比例为(35:65v/v)的甲醇。通过简单的蛋白沉淀法在Diamonsil C18(150mmX 4.6mm,5 μm)柱上提取血浆中的分析物。共收到27份血液样本,用于苯妥英药物监测。血液样本为济南齐鲁医院的27例癫痫患者。。结果:在0.2～20μg/mL的浓度范围时,(R2)0.999,可以获得优异的线性曲线。结果显示,所有进行的分析验证参数均在国际协调指导原则的公认范围内。结论:一种简单,快速,低成本,精确,新颖,极其灵敏,易于使用的LC/MS技术建立起来,并已在苯妥英TDM中进行了验证和高效应用。令人惊讶的是,观察到几乎所有患者的苯妥英血浆结果均超出参考范围,但两名患者除外;其苯妥英血浆浓度在参考范围内。但是需要进一步调查。该方法快速可靠。医生和临床医生可以随时获得治疗药物监测结果,以便做出理智快速的决定,更重要的是由于神经科医师的合理决定;癫痫患者可以以最小的苯妥英监测成本成功控制疾病症状,避免因为不可靠和不必要的重复药物监测过程来医院的不必要访问。该测定方法也可用于其他临床应用,如药代动力学,毒代动力学和生物等效性研究。拉莫三嗪背景:拉莫三嗪浓度水平和相关的临床毒性峰值可能出现不可预测的情况目的:本研究旨在建立并验证一种简单、敏感、快速、准确和经济的高压液相色谱-紫外检测方法,并常规用于癫痫患者拉莫三嗪血浆浓度测定。方法:采用高效液相色谱法(HPLC)测定常规接受拉莫三嗪治疗的癫痫患者血浓度。采用甲醇沉淀蛋白方法,以Diamonsil C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm,Waters-Milford,MA,United States.),以 0.1%三氟乙酸盐和甲醇(59:41,v:v)为流动相,流速为1.5ml/min,检测波长为260nm。结果:拉莫三嗪在1.0-50 μg/mL浓度范围呈现良好的线性关系(r2 =0.9961),定量下限为1.0 μg/ml。所有分析验证参数均在ICH(International Conference on Harmonisation)准则的可接受范围内。结论:本研究建立了简单、灵敏、快速和适用性良好的高效液相分析方法,并用于67份癫痫患者血浆拉莫三嗪浓度的监测。该方法可用于拉莫三嗪的常规治疗药物监测,也可用于拉莫三嗪的生物等效性研究、药代动力学研究、毒代动力学研究和药物警戒研究。左乙拉西坦背景:左乙拉西坦为抗癫痫药物,具有严重的临床毒性,可造成左乙拉西坦血浓度相关性红细胞和嗜中性粒细胞和红细胞压积计数减少,以及无力、嗜睡和头晕等。常规监测左乙拉西坦血浓度,有助于提高治疗效应,降低无效治疗和毒性治疗的发生率。目的:本研究旨在开发和验证一种简便、快速、可靠、经济、灵敏和准确的高压液相色谱-紫外检测方法,用于检测常规接受左乙拉西坦治疗的癫痫患者左乙拉西坦血浆浓度。方法:流动相为磷酸二氢钠(0.2mol/L,pH4.5)和乙腈以90:10(体积/体积)混合,流速为1.2ml/min,波长为210nm,色谱柱为Diamonsil C18(5μm,200mm×4.6mm,Waters-Milford,MA,US)。采用液液萃取法提取血浆左乙拉西坦,以咖啡因为内标。方法的特异性、回收率、准确度和精密度、稳定性验证均符合ICH(International Conference on Harmonisation)Q2(B)指导原则。结果:左乙拉西坦在1-160μg/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数为0.9990,定量下限为1μg/mL。提取效率左乙拉西坦为80%,内标为101%。稳定性结符合要求。结论:建立了用于定量测定人血浆中左乙拉西坦浓度的简单、可靠、高灵敏度、经济和快速的测定技术,并对方法进行验证。该方法可用于常规测定癫痫患者血浆中的左乙拉西坦,还可用于左乙拉西坦的生物等效性研究、药代动力学研究、毒代动力学研究和药物警戒研究等其他临床应用。第二部分:现代方法(酶倍增免疫分析技术;EMIT)用于TDM的卡马西平和苯妥英的开发和验证的LC/MS方法的相关性评估卡马西平背景:卡马西平具有可变的药代动力学特征,这可能容易引起卡马西平血浆水平的变化。因此,为了获得最大效力,安全性和避免毒性,需要对药物浓度进行常规测定。已经报道了许多精确和高灵敏度的色谱技术用于卡马西平的治疗监测,但是这些测定方法是复杂且昂贵的。免疫分析技术如酶复合免疫分析技术简单,快速且易于操作。它们经常用于卡马西平的常规治疗监测。目的:目前的工作旨在评估LC/MS技术与EMIT在癫痫患者血液中常规药物监测卡马西平的相关性。方法:分别采用LC/MS技术和EMIT技术,检测103个接受卡马西平治疗的癫痫患者血样本卡马西平血浆浓度。分别采用MedCalc和SPSS软件获得回归方程和bland-altman图,分析LC/MS技术和EMIT技术所测卡马西平血浓度数据的相关性。结果:LC/MS方法与EMIT的相关性良好(R2=0.971),酶倍增免疫技术卡马西平血浓度数据略高于LC/MS卡马西平血浓度数据。结论:本研究对LC/MS方法与EMIT方法所测的卡马西平血浓度数据相关性进行了验证和比较。两种检测方法间无显著性差异,LC/MS方法与EMIT之间有良好的相关性。作为金标准的液相色谱-质谱技术所测结果更准确且更易被接受。但酶倍增免疫测定技术更简单、便捷,检测结果当天即可得出,适用于卡马西平的常规药物监测。苯妥英背景:苯妥英是治疗范围较窄的药物。有强有力的证据显示苯妥英引起的危及生命和危险的皮肤不良反应,这在中国人群中经常报道,这表明中国人在使用苯妥英时出现更严重的不良反应的风险较高。目的:本研究旨在评估色谱-质谱法(LC/MS)与免疫分析法(EMIT)所测癫痫患者苯妥英血浓度测定的相关性,为实施苯妥英常规治疗的临床医生制定、调整、修饰给药方案提供决策依据。方法:本研究共收集27例癫痫患者血浆样本,分别采用所建立的LC/MS和EMIT技术测定苯妥英血浓度。分别采用MedCalc和SPSS软件获得回归方程和bland-altman图,分析LC/MS技术和EMIT技术所测卡马西平血浓度数据的相关性。所有样本均在山东大学齐鲁医院收集,研究工作在赫尔辛基宣言进行。结果:分别得到0.2-20 μ g/mL液相色谱/质谱法和2.5-40 μ g/mL酶扩增免疫分析技术的良好线性曲线。色谱的相关性;带免疫测定的LC/MS;EMIT法测定苯妥英钠含量较好(R2 = 0.921)。通过酶-倍增免疫测定技术测定的苯妥英血浆浓度略低于液相色谱/质谱法。95%置信区间为-21.4～14.3 ug/mL。两种技术的差异并不重要(P0.05)。这两种方法都适用于确定癫痫患者的苯妥英浓度。。结论:两种检测方法的具有良好相关性,液相色谱/质谱测定的苯妥英浓度略高于酶放大免疫测定技术的检测值。与两种测定技术原理不同有关,其临床意义有待进一步评价。第三部分:应用TDM评估卡马西平,苯妥英钠和丙戊酸对中国癫痫患者不同年龄和性别的临床反应,依从性,安全性和毒性卡马西平背景:卡马西平通常由神经精神科医生开具处方供癫痫患者使用的抗癫痫药物。其显著的的遗传差异、性别、年龄和种族对卡马西平血浆水平及其代谢产物的影响已得到公认。目的:卡马西平通常由神经病学家处方并建议癫痫患者使用抗癫痫药物,并且遗传差异,性别,年龄和种族对卡马西平血浆水平及其代谢产物的影响已得到公认。这项工作的目的是量化卡马西平血药浓度,并根据卡马西平的治疗药物监测结果评估和比较中国癫痫患者不同年龄和性别组的临床反应,依从性,安全性和毒性,因为汉族-当暴露于卡马西平时,中国人更容易发生严重和致命的副作用。方法:采用经验证的方法对卡马西平治疗的癫痫患者血浆浓度进行测定,并将测定结果汇总,评估、比较中国癫痫患者中不同年龄和性别人群的顺应性、安全性和毒性。将治疗药物监测结果按男性和女性分别分组,然后将每个性别组进一步分为儿童、成人和老年人的不同年龄组。分析、评估性别组、性别组内所有年龄组治疗范围、亚治疗范围和毒性范围。结果:研究结果显示,总样本中有45%的样本处于亚治疗水平,55%的样本卡马西平浓度水平处于治疗水平,所有性别和年龄组均未出现毒性水平。与男性相比,女性样本处于的亚治疗水平的人数更多。与成人和老年男性及成人和老年女性相比,男性儿童和女性儿童人群均有更多的人数处于亚治疗水平。但仍需更大样本的进一步评估。结论:本研究结果显示,大部分卡马西平血浆浓度结果的患者样本处于亚治疗水平,并且在这些患者中发现有不适的临床反应。建议必须常规监测卡马西平血浓度,并且只有在治疗药物监测结果出现后才能对癫痫患者的卡马西平给药剂量进行调整,以评估依从性,优化疗效,安全性并将毒性降至最低。苯妥英背景:苯妥英治疗指数较窄,具有非线性药代动力学特征,口服吸收不规则,给药剂量和临床效应间相关性不可预测,因此,须对癫痫患者实施苯妥英血浆浓度常规监测。目的:本研究旨在对未受控制的癫痫发作,怀疑不遵医嘱服药或有毒性反应的癫痫患者的苯妥英血浆浓度进行量化,以评估其依从性、安全性和毒性。方法:采用酶放大免疫测定技术对齐鲁医院神经内科提供的48例癫痫患者血样本进行苯妥英血浓度监测,包括对未受控制的癫痫发作或怀疑不遵医嘱服药或有毒性反应的癫痫患者的苯妥英血浓度监测。汇总所有患者苯妥英血浓度监测结果,评估患者依从性、安全性和毒性。结果:令人惊讶的是,在接受苯妥英治疗的癫痫患者中,大多数患者(85.5%)血浆浓度超出正常参考范围,其中69%的样本处于亚治疗水平,16.5%的样本处于毒性水平,仅14.5%的样本苯妥英水平在正常参考范围之内。苯妥英是狭窄治疗指数的药物。苯妥英具有非线性药动学,不可预测的吸收,剂量和临床应答之间的不可预测的链路,其支持用于定期确定癫痫患者苯妥英血浆浓度的需要。目的:本研究旨在量化苯妥英血浆药物浓度,以确定它们与中国癫痫患者的不同性别和不同年龄组的临床反应,不可控癫痫发作和毒性的可能关系。方法:齐鲁医院神经内科对48例癫痫持续发作或疑有不良反应的癫痫患者进行苯妥英药物监测。所有这些样品用酶增殖免疫分析技术进行治疗药物监测分析。结果:令人惊奇地发现,大多数85.5%的样品都是从基准范围,该样品的69%是在亚治疗水平和样品的16.5%的毒性水平和不利的临床反应在这些患者中,注意到的。所有测试样品中只有14.5%的苯妥英血浆浓度水平处于治疗水平。苯妥英血浆浓度的差异在不同性别和不同年龄组显着改变。与男性相比,与成人患者相比,女性和儿童患者样本的参考值范围增加。结论:该研究的结果表明,大多数患者的治疗结果超出参考范围,并且在这些患者中观察到不利的临床反应。我们推测,大多数这些患者的失控性癫痫发作或毒性和不良临床反应可能是由于超出苯妥英的治疗范围,尽管其他因素如遗传因素,遗传多态性的变化,个体内和个体间药代动力学变化参数,病理状况,药代动力学相互作用以及特定条件如妊娠和与药物年龄有关的身体反应也可能导致血浆浓度和治疗反应的变化。这些患者出现治疗范围的主要原因可能是依从性差,剂量不足,过量用药或患者自身采取的不适当的自我剂量,导致血浆浓度超出参考范围和不利的临床反应。儿童和婴儿是独特的群体,因为代谢速度快,消除时间快,分配值的体积大,女性在怀孕期间代谢速度快,消除速度快。这些因素在儿童,婴儿和女性中也可能是亚治疗水平的原因。但是,所有这些因素都需要进一步的警惕评估。在解释血浆浓度结果时,必须特别注意特定性别和特定年龄组,以便于修改剂量并开发最佳治疗方法并获得所需的临床反应,因为多种因素可以影响苯妥英血药浓度。通过这些结果,可以得出结论,苯妥英血浆浓度与临床反应之间存在良好的相关性。因此,在对癫痫患者开处方苯妥英之前,必须定期监测苯妥英和筛查HLA-A,B,C和DRB1基因型,以达到最大的临床反应并预防严重的毒性。丙戊酸背景:丙戊酸的给药剂量与血浓度间存在不可预测性和不利的相关性,显示有必要对其血浆浓度进行常规检测。目的:本研究是对丙戊酸的药物监测和丙戊酸治疗监测结果的对比评估,以评估中国癫痫患者不同年龄和性别组的临床反应,依从性,安全性和毒性。方法:采用酶放大免疫测定法检测206例(126例男性和80例女性)齐鲁医院神经内科接受丙戊酸治疗的癫痫患者丙戊酸血浓度。对不同年龄组和性别组癫痫患者丙戊酸血浓度监测结果进行汇总分析,比较评价患者依从性和丙戊酸安全性和毒性。将患者按男性和女性分组,然后将每个性别组进一步按年龄分为婴儿、儿童、成人和老年人组。对两个性别组的所有年龄组进行治疗范围、亚治疗范围和毒性范围的评估。结果:总样本中29%的样本处于亚治疗水平,13%的样本处于毒性水平,58%的样本丙戊酸水平处于治疗范围内。与男性样本相比,女性样本处于亚治疗水平的数量更多,而在毒性范围内的男性和女性数量相同。在男性患者中,与婴儿、成年和老年男性组相比,男性儿童组在亚治疗水平上具有更多的样本数量。在女性患者中,与儿童、成人和老年女性组相比,女性婴儿组在亚治疗水平上具有更多的样本数量。结论:本研究结果显示血浆浓度与临床反应之间的相关性很差。尽管治疗范围内的大部分样品存在不利的临床反应。女性患者,男性儿童患者和女性婴儿患者在亚治疗范围内的样本数量增加可能是由于依从性差或不合适的剂量导致不利的临床反应。性别组:女性和高龄患者组:儿童(男性)和婴儿(女性)可能需要更高的剂量才能达到最大的临床反应。但仍需进一步的评估。通过这些结果可得出结论,丙戊酸血浆浓度与临床反应之间相关性较差。第四部分:抗癫痫药物对癫痫患者体内维生素水平的影响背景:有研究报道显示,用抗癫痫药治疗可改变癫痫患者的维生素水平,且这可能介导抗癫痫药的不良作用。另一方面,许多研究表明维生素水平不受抗癫痫药物的影响。由于关于抗癫痫药物对血清维生素水平的影响没有明确的结论,需要进一步的临床研究以确定新型的和常规的抗癫痫药对癫痫患者血清维生素水平的影响,从而实现维生素补充剂的合理应用。许多报道指出,一些维生素的抗惊厥作用。正常维生素水平的变化可能严重影响整体健康状况。目的:本研究旨在证实长期接受抗癫痫药物治疗的癫痫患者维生素水平是否发生变化,变化是否与抗癫痫药的长期应用相关,何种维生素的水平受影响最大,以及维生素水平是否受性别和所使用的抗癫痫药的种类与数量有关。方法:本研究在山东大学齐鲁医院神经内科合作下进行展开。总共63份接受抗癫痫药单药或多药疗法治疗的癫痫患者的血清样本,同时,采用电化学分析方法,测定九种维生素血清水平。采用SPSS技术对癫痫患者血清中九种维生素(B1,B2,B6,B9,B12,A,C,D和E)的结果进行了分析和评估。所有维生素的分析是在我们的实验室使用相同的电化学分析进行的。结果:令人震惊的是,本研究中几乎所有(90%)癫痫患者的血清维生素D水平都非常低。值得注意的是,72%和46%癫痫患者维生素C和维生素B1也分别低于的参考范围。大多数患者的剩余维生素几乎都在参考范围内。在我们的研究中,维生素D,C和B1水平的平均值和频率在不同性别组之间变化不大。与接受传统抗癫痫药物的患者相比,接受新型抗癫痫药物的患者血清维生素D水平略有增加。我们发现单一治疗患者的维生素D,C和B1血清水平低于多疗法患者。结论:这项研究的最显着和令人惊讶的发现表明,几乎所有患者的血清维生素D水平都非常低,在一些患者中,维生素B1血清水平也低于参考范围。更重要的是,这里首次报道,大多数这些中国癫痫患者的维生素C血清水平也低于参考范围。建议除了抗癫痫药物的治疗药物监测外,还应定期监测所有这些维生素。还建议这些维生素血清水平低的癫痫患者可以使用维生素补充剂和抗癫痫药物,以更有效地控制其癫痫发作。更多的研究需要进一步的临床试验。全文结论本文对所建立癫痫患者体内5种抗癫痫药物血浓度和维生素水平的色谱检测方法与当前应用的检测方法进行了比较。本研究数据、结果、结论对临床医生改善癫痫患者致死性预后和有效控制癫痫症状具有重要意义。1.抗癫痫药物新方法的开发与验证1.1本研究建立并验证了两种简单、快捷、准确、灵敏度高、成本低的LC/MS方法,并用于卡马西平、苯妥英、拉莫三嗪和左乙拉西坦人体血浆浓度的测定。该方法提取步骤简单,血浆用量少,分析时间短,最低定量限低。1.2所建立方法成功用于癫痫患者相关治疗药物的监测(TDM),也可用于相关药物的生物等效性研究、毒代动力学研究和药代动力学研究。1.3本研究所建立方法具有以下优点,● 简单,快速,精确,高度灵敏,需血浆量更少的;● 适用于低浓度相关药物的定量分析;● 样品前处理简单,成本低,较少分析错误风险,比文献液-液萃取和固相萃取程序更快,更经济,更少污染物,有更好的回收率。● 单样本分析时间较文献中描述方法短;● 定量范围比文献方法更广泛;● 所建立方法的特异性,回收率,线性,稳定性和准确度以及精确度结果均在ICH原则的范围内。2传统酶倍增免疫分析技术(EMIT)与本研究所建立的LC/MS方法卡马西平和苯妥英血浓度相关性2.1 LC/MS和EMIT检测方法所测卡马西平和苯妥英血浓度数据,两方法间有良好相关性(R2分别为0.971,0.921);2.2但LC/MS方法更适于大样本检测,而EMIT更迅速,更适于常规检测。3.中国癫痫患者不同年龄和性别的临床反应,依从性,安全性和毒性3.1本研究显示,大部分接受苯妥英治疗患者以及接近一半接受卡马西平和丙戊酸治疗患者,血浓度超出有效治疗范围,从而产生无效治疗和不良反应;3.2卡马西平、苯妥英钠和丙戊酸血浓度存在差异,与性别和年龄有关,与依从性差、不足或过量用药有关;3.3卡马西平和苯妥英临床反应与血浓度呈正相关,但丙戊酸临床反应与血浓度呈负相关,具体机制尚需进一步研究证实。4.抗癫痫药物对癫痫患者维生素水平的影响4.1中国癫痫患者维生素D水平显著低于正常人群,维生素C和维生素B1也低于参考范围:4.2维生素D 水平因年龄、抗癫痫药物种类不同而异,与是否联合用药有关,但与性别无关;4.3维生素鉴于中国建议定期监测癫痫患者维生素水平,并根据检测数据,作为神经保护剂补充应用,避免维生素缺乏症,提高癫痫治疗的有效性,但须进一步的临床试验和调查。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R969


本文编号：2751506