PM2.5影响内皮细胞凋亡和通透性的机制及白藜芦醇干预研究

发布时间：2020-07-12 09:42

【摘要】：研究背景及目的:大气污染对公众健康的危害近年来引起了人们极大的重视。研究表明其中粒径小于2.5μm的微小颗粒物(fine particle matter,PM2.5)是造成危害的主要污染物~([1])。PM2.5不单能够经由呼吸道进入肺泡引起肺系疾病~([2]),进入肺泡后还可透过肺泡壁进入血液循环,可致使以肺及心血管系统为代表的多个系统产生疾病~([3])。PM2.5引发心血管疾病发病率及死亡率的增高和PM2.5加速动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)关系密切。PM2.5进入人体后可使血管内皮细胞氧自由基的表达增多,使细胞处于氧化应激状态,氧化应激可诱导产生炎症反应并且致使内皮细胞受损,进而导致以AS为代表的多种心血管疾病的产生。本课题组前期研究结果得出PM2.5作用于人血管内皮细胞会引起细胞的凋亡,并证明氧化应激介导该进程~([4])。有研究显示,持续或过强的氧化应激能够使内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应激活,二者还有相互促进的作用,循环放大反应进而加速细胞凋亡~([5-6])。内质网应激是各种因素致使内质网稳态失衡时产生的一种具有双向效应的应激反应,早期可保护细胞减轻损害,应激反应持续则其最终结果可致使细胞凋亡~([7]),且细胞的稳态与通透性变化关系密切。在此基础上,我们有理由相信,PM2.5可能经由激活内质网应激相关机制引发内皮细胞凋亡并致使内皮细胞通透性发生改变。白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种对多种疾病多个系统有广泛药理作用的一类多酚类活性物质,其中在心血管系统疾病方面的药理作用尤其明显~([8])。我们前期试验证实白藜芦醇可以通过缓解氧化应激反应来保护PM2.5引起的内皮细胞凋亡~([4])。本实验将在前期研究结果的基础上从内质网应激来研究PM2.5引起血管内皮细胞凋亡的机制,并进一步研究白藜芦醇对PM2.5诱导的EA.hy926细胞凋亡和通透性的改变的影响,探讨白藜芦醇对心血管系统的保护作用及其可能机制,为白藜芦醇用于治疗和预防PM2.5致使的心血管疾病及其相干并发症提供实验根据。方法:1.内质网应激在PM2.5诱导血管内皮细胞凋亡中的影响:(1)EA.hy926细胞分为空白对照组、PM2.5不同浓度组(PM2.5终浓度分别为25、50、100、200μg·mL~(-1)),通过qRT-PCR法检测各组内质网应激相关分子GRP78、XBP1、CHOP的mRNA表达情况,通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测PM2.5对EA.hy926细胞内质网应激相关蛋白GRP78、XBP1、PERK、ATF4、CHOP表达的影响。(2)设置对照组、PM2.5组(用PM2.5 100μg·mL~(-1)处理)、control-siRNA组、control-siRNA+PM2.5组(转染control-siRNA后用PM2.5进行干预)、si-PERK组、si-CHOP组和si-JNK组(分别转染对应的siRNA),si-PERK+PM2.5组、si-CHOP+PM2.5组和si-JNK+PM2.5组(分别转染对应的siRNA,再用PM2.5进行干预),处理EA.hy926细胞24h后,用Western blot法检测内质网应激相关分子PERK、CHOP蛋白的表达变化。用qRT-PCR法检测各组细胞PERK、CHOP、JNK mRNA的表达情况,用流式细胞术通过Annexin V-FITC/PI双染后检测各组细胞凋亡的变化。(3)分为空白对照组、PM2.5组(用PM2.5 100μg·mL~(-1)处理)、4PBA组、4PBA组+PM2.5组(用终浓度为1mmol·L~(-1)的4PBA预处理1 h再给予100μg·mL~(-1)的PM2.5),24小时后使用流式细胞仪通过Annexin V-FITC/PI双染观察各组凋亡的变化。2.PM2.5诱导EA.hy926细胞通透性改变影响:(1)将状态良好的EAhy926细胞接种于Transwell板上,每12h测细胞跨膜电阻(TEER)并记录数值,连续两次数值相近时细胞间为形成紧密链接。(2)EA.hy926细胞接种待形成紧密连接后分为对照组、PM2.5不同浓度组(终浓度分别为50、100、200μg·mL~(-1)),Millicell ERS-2细胞电阻仪检测各组细胞跨膜电阻值(TEER)的变化。(3)待EA.hy926细胞成紧密单层后,分为对照组、PM2.5组(用PM2.5 100μg·mL~(-1)处理)、4PBA组、4PBA组+PM2.5组(用终浓度为1 mmol·L~(-1)的4PBA预处理1 h再给予100μg·mL~(-1)的PM2.5),用Millicell ERS-2检测24小时各组的跨细胞膜电阻值。3.白藜芦醇对PM2.5导致的EA.hy926通透性和细胞内质网应激的影响:EA.hy926细胞分为对照组、PM2.5组(终浓度为100μg·mL~(-1))、PM2.5组+RES低浓度组(终浓度为5μmol·L~(-1)的白藜芦醇预处理1h后给以PM2.5终浓度为100μg·mL~(-1))、PM2.5组+RES中浓度组(终浓度为10μmol·L~(-1)的白藜芦醇预处理1h后给以PM2.5终浓度为100μg·mL~(-1))、PM2.5组+RES高浓度组(终浓度为20μmol·L~(-1)的白藜芦醇预处理1h后给以PM2.5终浓度为100μg·mL~(-1)),用Millicell ERS-2细胞电阻仪检测并记录各组的细胞跨膜电阻值变化,qRT-PCR法检测各组内质网应激相关mRNA GRP78、XBP1、CHOP的表达情况,用Western Blot检测PM2.5对EA.hy926细胞XBP1、GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达程度的影响。4.白藜芦醇对PM2.5诱导的EA.hy926细胞miRNA差异表达的研究:EA.hy926细胞分为对照组、PM2.5终浓度100μg·mL~(-1)组,白藜芦醇+PM2.5组(终浓度为20μmol·L~(-1)的白藜芦醇预处理1h后给以PM2.5终浓度为100μg·mL~(-1)),刺激24小时后提取细胞RNA,进行microRNA测序,对表达差异的miRNA进行验证和功能研究。结果:1.(1)与对照组比较,PM2.5浓度25、50,、100、200μg·mL~(-1)组细胞内质网应激相关GRP78、XBP1、CHOP mRNA随PM2.5浓度升高而表达上升,内质网应激相关GRP78、XBP1、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达随PM2.5浓度升高而表达上升,且均具有统计学意义。(2)与PM2.5浓度100μg·mL~(-1)组比较,转染PERK siRNA、CHOP siRNA组PERK、CHOP蛋白质表达均下降,转染PERK siRNA、CHOP siRNA组的细胞凋亡率均下降且均具有统计学意义,转染JNKsiRNA组细胞的凋亡有所下降,但无统计学意义。(3)与PM2.5浓度100μg·mL~(-1)组比较,4PBA预处理组的凋亡率明显下降,具有统计学意义。2.与对照组比较,PM2.5不同浓度组TEER值表达均明显下降,与PM2.5(100μg·mL~(-1))组比较,4BPA+PM2.5(100μg·mL~(-1))组TEER值表达明显上升。3.与PM2.5组比较,不同浓度RES预处理组TEER值均上升且具有统计学意义;GRP78、XBP1、CHOP mRNA的表达均下降具有统计学意义。GRP78、XBP1、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达表达均下降具有统计学意义。4.经过miRNA表达差异分析及验证,与对照组相比,PM2.5组miR-1246明显上升,与PM2.5组相比,has-miR-1246-micmics+PM2.5组凋亡率增高,而has-miR-1246-inhibitor+PM2.5组细胞凋亡率下降,说明miR-1246介导了PM2.5诱导的内皮细胞凋亡;白藜芦醇预处理组和PM2.5组比较,miR-1246表达明显下降,结果提示白藜芦醇干预PM2.5引起的凋亡与hsa-miR-1246密切相关。结论:1.PM2.5可能通过影响激活内质网应激途径引发EA.hy926细胞凋亡和通透性改变。2.白藜芦醇预处理可明显抑制PM2.5引起的EA.hy926细胞通透性改变及凋亡,发挥保护作用,这可能是通过干预内质网应激途径发挥作用的。3.白藜芦醇可通过调控miR-1246的表达来影响PM2.5引起的EA.hy926细胞凋亡。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R994.6
【图文】：

蛋白质表达,学位论文,内质网,内皮细胞

广州中医药大学 2018 届硕学位论文6.2 PM2.5 引起 EA.hy926 内质网应激相关蛋白质表达的影响如图 2 所示，与对照组比较，PM2.5 25、50、100、200μ g mL-1浓度组 GRP1、PERK、ATF4、 CHOP 表达均明显上升(p ＜0.05)，此结果提示 PM2.5 可内皮细胞 EA.hy926 内质网应急途径激活。

白藜芦醇,相关蛋白,应激,内质网

PM2.5 影响内皮细胞凋和通透性的机制及白藜芦醇干预研究2.2.5.3 Western blot 检测白藜芦醇对内质网应激途径相关蛋白质的表达如图 12 所示，与对照组比，PM2.5 组 GRP78、PERK、ATF4、 CHOP 表达均升(p＜0.05)，与 PM2.5 组相比，白藜芦醇不同浓度预处理均能使 GRP78、PERK、ATFCHOP 表达下降(p＜0.05)，提示白藜芦醇对 PM2.5 引起的内质网应急途径激活有抑作用。

【参考文献】