以肿瘤细胞为模版的多酚-铝配位微颗粒疫苗制备方法及肿瘤免疫治疗效果

发布时间：2020-07-12 14:37

【摘要】：目的:促进抗原提呈细胞摄取、呈递肿瘤抗原,是构建肿瘤疫苗需要考虑的重要因素。单纯的肿瘤抗原免疫原性差,采用合适的负载体系对于增强抗原的摄取、提呈,特别是诱导T细胞免疫应答是非常重要的。本文通过多酚金属的络合作用,以单个细胞为模版,构建了负载肿瘤细胞裂解物的微颗粒体系,该体系能够有效刺激抗原提呈细胞对肿瘤抗原的吞噬提呈并激活细胞免疫反应。本工作提供了一种通用、简单、有效的肿瘤抗原包封策略,将单个肿瘤细胞包埋得到肿瘤疫苗,可以用于个体化免疫治疗。方法:通过透射电镜,扫描电镜,共聚焦显微镜观察TCL@EGCG/AIn微颗粒结构;利用X射线光电子能谱(XPS)及X射线能谱(EDS)检测其组成成分;利用BCA法测定TCL@EGCG/AIn的蛋白负载能力及在不同pH环境下的蛋白释放情况;通过激光共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy,LSCM)及流式细胞技术(Fluorescence Activated Cell Sorter,FACS)分析 DC 细胞对 TCL@EGCG/AIn的摄取;通过活体成像观察TCL@EGCG/AIn负载的抗原蛋白在体内的迁移情况;采用流式细胞仪检测TCL@EGCG/AIn促进骨髓来源树突状细胞成熟的能力;通过动物实验模型观察其预防治疗以及抑制肿瘤转移的效果。结论:成功制备了 EGCG/AI包裹肿瘤细胞裂解物的微颗粒疫苗,并确定了其形貌成球状。该微颗粒疫苗具有较高的蛋白负载量及pH响应性蛋白释放特性,在pH 5.5时释放较快。细胞毒性结果显示该具有良好的生物相容性,可以被BMDCs细胞摄取,并活化刺激BMDCs成熟。皮下注射微颗粒疫苗后6 h迁移至淋巴结,48小时内荧光不消失。动物实验结果表明该微颗粒疫苗在一定程度上可以预防和抑制肿瘤的生长和转移。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;R730.51
【图文】：

（ｄ）为低倍镜下ＳＥＭ图像。可以看出ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１！微颗粒表面有塌陷现象，逡逑而ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微颗粒没有，球形结构完整，说明ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微颗粒更稳逡逑定。图２－２（ｅ）（ｆ）为Ｂ１６细胞ＳＥＭ图像，从图中可以看出，Ｂ１６细胞表面光滑；逡逑与Ｂ１６细胞相比，微颗粒形貌成球形，表面粗糙，直径约为７邋ｎｍ，略小于Ｂ１６细逡逑胞。ＳＥＭ在真空条件下进行，表明ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微颗粒具有良好的物理稳定性。逡逑图２－３为Ｂ１６细胞与ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微颗粒的ＴＥＭ超薄切片图，从图中可以看逡逑出，微颗粒表面有一层连续致密层包裹，与Ｂ１６细胞表面有明显区别。逡逑１８逡逑

图２－４邋（ａ）邋（ｂ）分别为ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ标记的Ｂ１６细胞（ａ）和ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｂ微颗粒（ｂ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋ＣＬＳＭ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋Ｂ１６邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｅｆｏｒｅ邋（ａ）邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋（ｂ）邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ｂｙ邋ＥＧＣＧ／Ａ１邋ｌａｙｅｒ．逡逑由图２－５邋Ｂ１６细胞与ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３微颗粒的ＸＰＳ和ＥＤＳ图谱可知，逡逑ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｌ３邋由邋Ｃ、Ｎ、０、Ｎ、Ｓ、ＡＩ邋元素组成。对比邋Ｂ１６邋细胞与邋ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａｌ３逡逑的图谱，ＴＣＬ＠ＥＧＣＧ／Ａ１３的ＸＰＳ和ＥＤＳ图谱有ＡＩ元素的存在，而Ｂ１６无ＡＩ元逡逑素。上述实验结果都证明了邋ＥＧＣＧ／ＡＩ结构的形成。逡逑Ｖａ；邋Ｃｌｓ邋８１．５０逦Ｗ邋ＣＩＳ邋６０．４３邋ｇ邋0逡逑广ｖ逦Ｎｌｓ逦３．７４逦一逦Ｎｌｓ逦１８．１０逡逑＾逦Ｏｌｓ逦１３．３８逦２逦０１ｓ逦１８．６９逡逑３逦Ｐ２ｐ逦１．１１逦？逦Ｓ逦：ｄ逦Ａ１２ｐ逦１．０５逡逑ｔ邋＿邋」％邋０．２６邋°邋ｔ邋＃rP常rP樱rP玻]3?Ｉ邋ｙｉ邋0逦？邋ＩＡＪ逦ｔ逡逑工邋ａ逦１邋一Ｈ逡逑＼＼邋ｏｐ邋Ｑ－邋0逦１逦ｃ／）0－＜Ｖ逡逑ｉ逦，逦ｉ邋■邋ｉ邋■邋ｉ逦，逦ｉ逦＇逦ｒ＊逦＊■邋ｉ－逦＞．逦逦ｉ邋■逦｜逦．邋ｉ逦，逦ｉ逦ｉ邋．Ｕ■—产？▲、逡逑１２００邋１０００逦８００逦６００逦４００逦２００逦０逦１２００逦１０００逦８００逦６００逦４００逦２００逦０逡逑Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｅｎｅｒｇｙ邋（ｅＶ）逦Ｂｉｎ?

ｕｍｍｍ逡逑■■W逡逑图２－６四种肿瘤细胞与其经过ＥＧＣＧ／ＡＩ包裹后ＳＥＭ图像逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－６邋ＳＥＭ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋４Ｔ１．邋ＣＴ２６，邋ＭＢ４９邋ａｎｄ邋ＨＬ－６０邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｃｏａｔｉｎｇ邋ｂｙ邋ＥＧＣＧ／Ａ１逡逑ｌａｙｅｒ．邋Ｕｎｃｏａｔｅｄ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｆｉｘｅｄ邋ｂｙ邋ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ邋ｆｏｌｌｏｗｅｄ邋ｂｙ邋ｗａｓｈｉｎｇ邋ｗｉｔｈ邋ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ邋ｗａｔｅｒ．逡逑为了验证这种方法的通用性，我们尝试了用另外三种鼠源肿瘤细胞：小鼠乳腺逡逑癌细胞（４Ｔ－１）、小鼠结肠癌细胞（ＣＴ－２６）、小鼠膀胱癌细胞（ＭＢ４９），一种人源肿逡逑瘤细胞：人急性早幼粒白血病细胞（ＨＬ－６０），以及一种鼠源非肿瘤细胞？．小鼠树突逡逑状细胞（ＤＣ邋２．４）进行包裹，并通过扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察其形逡逑２１逡逑

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本文编号：2752100