猪源纤维蛋白粘合剂对创口粘合作用及其机制研究

发布时间：2020-07-12 18:24

【摘要】：目的:缝合常应用于临床手术中创口的封闭,但其不仅难以应用于脆性器官、难以防止组织体液外漏和易引起肥厚性瘢痕增生等。尤其是随着愈合的进展,如何快速有效地促进创面闭合的同时减少瘢痕的形成已成为大家重要的关注点。自1998年以来,FDA批准纤维蛋白粘合剂(FS)在美国使用。之后其被临床广泛应用于封闭和粘合,并且不断推出新产品适用于新的适应症。随着医学的进步和对敷料的严谨性越来越高,具有可降解性和良好生物相容性的纤维蛋白粘合剂已成为粘合封闭创面的首选之一。然而目前国内上市的纤维蛋白粘合剂主要的临床适应症均为止血作用而非粘合作用,因此本研究在成功研发一款新型猪源纤维蛋白粘合剂基础上,围绕该粘合剂对皮肤创伤愈合的作用效果及其机制进行一系列的研究,旨在确定该粘合剂对皮肤愈合的疗效,初步验证其粘合效果,为该粘合剂在临床上应用于皮肤创面治疗提供实验依据。方法:1.CCK-8法检测猪源纤维蛋白粘合剂对L929和HUVECs细胞毒性研究;通过显微镜观察细胞生长形态进一步验证猪源纤维蛋白粘合剂对细胞毒性作用;采用Hoechst/PI双染法进一步探究猪源纤维蛋白粘合剂对L929和HUVECs细胞凋亡的影响。2.通过在SD大鼠背部处皮肤构建一道长为4 cm的全层刀伤模型,给予不同处理方法。通过愈合组织部位拉伸强度,HE染色和Masson三色染色探究猪源纤维蛋白粘合剂对其愈合效果。3.通过Q-PCR和Western Blot从分子和蛋白水平探究猪源纤维蛋白粘合剂促进创口愈合机制研究。结果:1.猪源纤维蛋白粘合剂浸提液分别作用于L929和HUVECs细胞24 h、48 h和72 h后,L929细胞存活率分别为84.64±1.66、81.97±0.31和83.98±2.42,其存活率低于空白对照组(P0.05)。而猪源纤维蛋白粘合剂浸提液对HUVECs细胞在24 h、48 h和72 h时细胞存活率分别为98.76±6.07、96.80±1.88和88.74±2.21,由此可得猪源纤维蛋白粘合剂浸提液处理HUVECs细胞24 h、48 h后对细胞并没有显著性影响,但在72 h时其存活率低于空白对照组(P0.05)。根据标准对粘合剂浸提液的细胞毒性进行判定,猪源纤维蛋白粘合剂细胞毒性为0-1级别,毒性较小。通过显微镜观察进一步验证了猪源纤维蛋白粘合剂对L929和HUVECs细胞形态结果显示其对细胞生长形态没有显著性影响。深入验证猪源纤维蛋白粘合剂对细胞凋亡的影响可发现猪源纤维蛋白粘合剂浸提液处理细胞24 h后,细胞凋亡不明显,与对照组没有显著性差异。进一步提示了猪源纤维蛋白粘合剂毒性较小,具有良好的生物相容性。2.建立SD大鼠背部皮肤创伤愈合模型,通过其愈合组织拉伸强度初步判断其伤口愈合速度,结果提示了在愈合初期开始时猪源纤维蛋白粘合剂对伤口愈合起了促进的效果。接着对伤口愈合部位进行HE和Masson染色从病理形态上验证了猪源纤维蛋白粘合剂能够较快地促进表皮再上皮化和胶原沉积从而促进伤口的愈合。3.采用Q-PCR实验探究猪源纤维蛋白粘合剂对与促进皮肤愈合的VEGFA mRNA、bFGF mRNA、CollagenⅠmRNA和TGF-β1 mRNA表达影响和应用Western Blot探究猪源纤维蛋白粘合剂对VEGFA、bFGF、CollagenⅠ、TGF-β1和α-SMA蛋白的表达影响。实验结果显示Q-PCR结果与Western Blot结果几乎一致,在愈合初期,猪源纤维蛋白粘合剂通过上调bFGF、VEGFA和α-SMA而促进了伤口愈合,同时下调了与瘢痕相关的CollagenⅠ、TGF-β1蛋白表达。在愈合重塑期,猪源纤维蛋白粘合剂组及时促进了成肌纤维细胞的凋亡,降低了α-SMA蛋白的表达。结论:猪源纤维蛋白粘合剂具有良好的生物相容性,能够促进皮肤伤口愈合。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96
【图文】：

广东药科大学硕士研究生学位论文2.4.2 显微镜下观察猪源纤维蛋白粘合剂对 L929 和 HUVECs 生长状态的影响观察纤维蛋白粘合剂浸提液作用 24 h 后对 L929 细胞的生长状态的影响，结果如图 2-2。对照组和纤维蛋白粘合剂组的细胞均生长良好，形态分明，且分布较密集。但是纤维蛋白粘合剂细胞数量略少于对照组。而对于 HUVECs 细胞中，对照组与纤维蛋白粘合剂组中细胞数量差异不明显，细胞生长状态均良好，轮廓清晰，见图 2-3。（a）（b）

见图 2-3。图 2-2 猪源纤维蛋白粘合剂浸提液对 L929 细胞生长状态的影响(×100)（a）对照组；（b）猪源纤维蛋白粘合剂Fig.2-2 Effect of PFS extract on the growth status of L929 cells(×100)（a）control group；（b）PFS group（a）（a）（b）（b）

为了验证猪源纤维蛋白粘合剂浸提液分别作用于 L929 和 HUVECs 细胞是否具有促进凋亡作用，采用 Hoechst/PI 双染法检测猪源纤维蛋白粘合剂浸提液对L929 和 HUVECs 细胞凋亡影响。Hoechst 是具有穿透细胞膜的能力，且对细胞活性影响较小的在紫外光激发下显示蓝色的荧光染料。在荧光显微镜下正常的细胞显示出弱淡蓝色，而凋亡细胞因其染色质会固缩从而在荧光显微镜下显示出亮蓝色[75]。PI 只能穿透无完整性细胞膜的坏死细胞和凋亡晚期细胞从而在荧光显微镜下显示出红色。Hoechst 阴性和 PI 阴性为正常活细胞，Hoechst 阳性和 PI阴性为凋亡细胞，Hoechst 阴性和 PI 阳性为坏死细胞。猪源纤维蛋白粘合剂浸提液分别作用于 L929 和 HUVECs 细胞 24 h 后，细胞的凋亡形态见图 2-4 和图 2-5。无论在空白对照组和猪源纤维蛋白粘合剂组中，细胞染色均匀发出淡蓝色荧光，早期凋亡细胞较少且与空白对照组无明显差异，显示了猪源纤维蛋白粘合剂浸提液无促凋亡作用，再一次验证了猪源纤维蛋白粘合剂浸提液对 L929 和 HUVECs细胞无毒性或毒性较小。Hoechst PI Mergea）

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本文编号：2752334