两种酶偶联再生辅酶NAD（H）催化体系的构建及应用

发布时间：2020-07-15 03:48

【摘要】：辅酶原位再生系统是指在依赖辅酶的反应系统内部,用催化氧化/还原的方法实现辅酶在氧化态与还原态之间的循环。这种催化辅酶再生的方法可以大幅减少工业生产中辅酶的投入量,减少生产成本。本研究利用偶联醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶构建NADH再生系统,将该系统应用于药物中间体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]的合成。利用偶联阿拉伯糖醇脱氢酶和NADH氧化酶构建NAD~+再生系统,并应用于稀有糖L-木酮糖的合成,具体研究内容如下:(1)表达载体的构建和转化:从菌株Bartonella apis,Bacillus sp.ZJ和Aspergillus nidulans中抽提基因组DNA,通过PCR技术克隆出目的基因,根据来源物种名称,将醇脱氢酶,葡萄糖脱氢酶和阿拉伯糖醇脱氢酶分别命名为BaADH,BsGDH和ArDH。将目的基因连接到表达质粒pET-28a(+)上,并将重组质粒转化到表达宿主E.coli BL21中。(2)酶的表达和性质表征:BaADH和ArDH的最适温度分别为50℃和40℃,分别在pH为8.0和9.5的缓冲液中表现出最大活性;添加Mn~(2+)能明显提高酶的活性。在30℃时,BaADH在保温35 h后失去一半活性,而ArDH的活性半衰期为8.3 h。米氏常数测定的结果显示,对于BaADH,V_(max)=190.4 U/mg,K_m=0.11mM;对于ArDH,V_(max)=9.1 U/mg,K_m=1.2 mM。(3)利用BaADH-BsGDH构建NADH辅酶再生体系,分别对反应温度、pH、辅酶浓度和底物浓度进行优化。结果表明,使用pH 7.0 Tris-HCl缓冲液,该催化系统在35℃反应8 h后,100 mM的COBE的转化率达到94.9%,NADH浓度为0.5μM时,辅酶总转化数(TTN)达到5940,可满足工业应用的要求。(4)利用ArDH-Nox构建NAD~+辅酶再生体系,对系统的催化反应条件进行优化。结果表明在pH 5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中30℃催化氧化20 mM阿拉伯糖醇,反应8 h的转化率达到91.5%,NADH浓度为5μM时,最高TTN值为1020。本文建立了辅酶NAD(H)的酶偶联再生系统,利用该辅酶再生体系实现了药物中间体和稀有糖的酶促生产,体现辅酶再生系统在工业生产中的应用潜力。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914
【图文】：

示意图,辅酶,偶联,示意图

图 1.1 偶联酶再生辅酶示意图.1 Cofactor regeneration by enzyme coupling 辅酶时，由于其只需要辅底物而不需要偶联置，节省了偶联酶表达和纯化所需的生产成条件反应不一样时，有必要优化条件并找到H。底物偶联法单酶催化的特点避免了主反制性影响，但底物偶联法的局限性也是很明要该酶既能利用一种底物进行氧化还原的主再生的副反应（图 1.2）。

示意图,辅酶,底物,示意图

图 1.2 通过共底物再生辅酶示意图 1.2 Cofactor regeneration by substrate coupling me关的酶进行再生的过程中，通常是引入例如甲酸脱氢酶氧化还原酶消耗 NADH 进行主反应的同时，偶联第二底物进行氧化反应[21]。而关于氧化型辅酶 N氧化酶催化氧化 NADH 进行氧化型烟酰胺的再生置，操作简单，适用范围广，以及廉价的额外底用的一种方法。另外，由于一些主反应的酶专一物来启动酶的另一个反应，利用单个酶即可达到

辅酶再生,木酮糖,体系,葡萄糖脱氢酶

种辅酶再生体系生产（A）(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和（B糖Fig 1.3 Two coenzyme regeneration systems which produce (A(S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate and (B) L-xylulose的主要研究内容原酶的克隆表达基因挖掘，筛选含有醇脱氢酶，葡萄糖脱酶基因的菌株，抽提菌株的基因组 DNA，用设计的引物扩增，并连接到大肠杆菌表达质粒上，构建重组表达宿主。 BaADH 和葡萄糖脱氢酶 BsGDH 的性质表征，偶联构建

【参考文献】