胰岛素诱导C2C12细胞增殖和凋亡的机制研究

发布时间：2020-07-15 04:26

【摘要】：目的 胰岛素是一类在人类胰腺中发现的分泌肽激素，它能提高葡萄糖的利用率。已有研究发现胰岛素能诱导C2C12细胞（小鼠成肌细胞，即肌前体细胞）增殖和肌细胞生成。胰岛素如何诱导C2C12细胞增殖的作用机制尚不明确。GATA-6是具有锌指结构的转录因子。GATA-6在心肌细胞分化和保持血管平滑肌细胞分化表型中发挥重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）在脂类代谢如脂肪酸转运和β-氧化中起着重要调节作用。GATA-6和PPARα是否参与胰岛素对细胞增殖和凋亡的调节将是一项很有趣的研究。细胞凋亡受BCL-2家族蛋白（B-细胞淋巴瘤-2）的调节，BAD（细胞凋亡BCL-2促凋亡蛋白）是BCL-2家族成员之一，能够诱导细胞凋亡。CyclinD1是D型细胞周期蛋白的一种。能与CDK4和CDK6作用激活细胞进入细胞周期。但是有关cyclinD1和BAD在胰岛素处理的C2C12细胞中的表达却知之甚少。 方法 本研究中我们用MTT法、流式细胞分析、细胞凋亡定量、DAPI染色、荧光素酶报告基因实验、Quantitative Real-Time PCR及Western Blot实验来研究胰岛素对C2C12细胞增殖、凋亡和细胞周期的作用。 结果 MTT实验结果表明10nM的胰岛素处理C2C12细胞促进细胞增殖（P＜0.01），而50nM和100nM的胰岛素处理则诱导C2C12细胞凋亡。与对照细胞相比，过表达GATA-6能促进C2C12细胞生长（P＜0.01），这种促进作用在给予10nM胰岛素处理后得到增强而50nM和100nM胰岛素处理后该促进作用被逆转。过表达GATA-6和PPARα虽然诱导细胞增殖但不能逆转50nM和100nM胰岛素诱导产生的细胞凋亡。 流式细胞分析表明10nM胰岛素促进细胞周期进程，50nM和100nM胰岛素则将细胞周期阻滞在S期。过表达PPARα/GATA-6促进细胞周期进程，在10nM胰岛素处理时该促进作用增强，而50nM和100nM胰岛素处理时则逆转该作用诱导细胞周期阻滞。且PPARα和GATA-6均不能缓解50nM和100nM胰岛素产生的该阻滞作用。 DAPI染色结果显示与对照细胞相比50nM和100nM胰岛素处理的细胞表现出较高水平的染色质固缩，而10nM胰岛素处理的细胞染色均匀未表现出细胞凋亡后染色质固缩。PPARα和GATA-6均不能逆转50nM和100nM胰岛素诱导的细胞凋亡染色质固缩。 荧光素酶报告基因瞬时转染实验表明不同浓度胰岛素分别诱导cyclinD1和BAD的转录。10nM胰岛素激活cyclinD1启动子活性，抑制BAD启动子的活性，促进细胞增殖。而50/100nM胰岛素则激活BAD的启动子，抑制cyclinD1启动子活性，诱导细胞凋亡。GATA-6和PPARα均能增强cyclinD1启动子活性，逆转50nM胰岛素诱导的cyclinD1启动子活性的降低，却不能逆转100nM胰岛素产生的作用。而且，GATA-6和PPARα均能抑制50nM和100nM胰岛素诱导的激活BAD启动子活性的作用。 Quatitive Real Time-PCR和Western Blot分析发现10nM和50/100nM胰岛素处理细胞分别诱导cyclinD1和BAD的表达。10nM胰岛素处理诱导cyclinD1的表达（P0.01），50/100nM胰岛素处理则抑制cyclinD1的表达（P＜0.01），促进BAD的表达。在过表达GATA-6或PPARα的C2C12细胞中也得到了相同的实验结果。虽然过表达GATA-6的细胞中cyclinD1的表达显著升高（P＜0.01），但是却不能逆转50nM和100nM胰岛素诱导产生的cyclinD1表达降低和BAD表达升高。我们的实验结果显示胰岛素通过调节cyclinD1和BAD的表达诱导细胞增殖和凋亡。进一步阐述了胰岛素促进C2C12细胞增殖和凋亡这一作用机制。 结论 以上数据表明胰岛素以剂量依赖的方式双向诱导C2C12细胞增殖和凋亡，cyclinD1和BAD参与胰岛素调节细胞生长的作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96
【图文】：

第四章 实验结果4.1 不同浓度胰岛素对细胞增殖的影响为了阐明胰岛素在细胞生长中的作用我们将C2C12细胞接种到96孔板中，随后分别用 10nM、50nM、100nM 胰岛素处理 24 小时。用 MTT 法检测细胞活力。如图 4.1 所示，与对照细胞相比 10nM 胰岛素处理的 C2C12 细胞活力增加了 76%。而 50nM 胰岛素处理的 C2C12 细胞活力降低了 21%，100nM 胰岛素处理的 C2C12 细胞活力降低了 32%。数据分析表明 10nM 胰岛素处理和未用处理的对照细胞表现出明显的不同（P＜0.01）（图 4.1）。以上数据表明胰岛素以剂量依赖性的方式促进 C2C12 细胞增殖和拮抗增殖的作用。10nM 胰岛素促进细胞增殖，而 50nM 和 100nM 胰岛素则抑制细胞增殖。

4.2 不同浓度胰岛素对细胞周期的影响为了证明 50nM 和 100nM 胰岛素拮抗 C2C12 细胞增殖的作用是否是由于其阻滞了细胞周期而引起的，我们进行了流式细胞分析。我们分别将 10nM、50nM、100nM 胰岛素处理 24 小时后的 C2C12 细胞在 PI 染色后进行 FACS 分析。与对照细胞相比 10nM 胰岛素处理的 C2C12 细胞 G0/G1期所占百分比降低了 24% 而 G2/M 期比值增加了 37% （图 4.2）。MTT 实验表明 10nM 胰岛素促进细胞增殖，与 10nM 胰岛素处理的细胞相比 50nM 胰岛素处理的 C2C12 细胞表现出 S 期增加 66% ，G2/M 期的比值降低了 7%。100nM 胰岛素处理的细胞 S 期增加了 71% ，G2/M 期的比值降低了 12%（图 4.3）。以上结果表明 50nM和 100nM 胰岛素处理诱导 C2C12 细胞细胞周期阻滞在 S 期。

4.3 不同浓度胰岛素对细胞凋亡的影响 细胞流式分析表明 50nM 和 100nM 胰岛素由于阻滞细胞周期而引起拮抗细胞增殖的作用。为了研究 50nM 和 100nM 胰岛素拮抗细胞增殖的作用是否由于其诱导细胞凋亡引起的，我们分别检测 10nM、50nM 和 100nM 胰岛素处理 24小时的 C2C12 细胞凋亡染色质固缩的情况。用 DAPI 对细胞核 DNA 进行染色质着色。染色的细胞核呈蓝色，20X 物镜下成像观察，并拍摄图像。与对照细胞相比 50nM 和 100nM 胰岛素处理的细胞表现出较高水平的染色质固缩，并有颗粒物质形成。而 10nM 胰岛素处理的细胞与对照细胞细胞核完整且染色均匀，未表现出细胞凋亡后的染色质固缩（图 4.3）。该结果表明胰岛素以剂量依赖的方式双向诱导 C2C12 细胞凋亡。

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 张乾勇;PPAR的结构与功能及其生物学作用[J];国外医学(卫生学分册);2000年05期

2 鲁晓杰;陈开来;罗其中;;过氧化物酶体增殖因子活化受体γ和神经系统疾病[J];国际神经病学神经外科学杂志;2006年01期

本文编号：2755979