【摘要】:目的:表皮生长因子(EGFR)作为ErbB家族的成员之一,是细胞受体中研究最多的细胞信号受体之一。作为第一个被鉴定为蛋白质-酪氨酸激酶的受体,EGFR在调节细胞凋亡,细胞周期进程、分化和转录中起着重要的作用。EGFR的突变和过表达与许多癌症的发生、发展和预后相关,已成为非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、头颈癌和结直肠癌等多类恶性肿瘤治疗的热门靶点之一。目前上市的针对EGFR靶点的药物表现出临床反应率低和耐药性的问题,EGFR分子表面的遗传性和病理性突变以及EGFR与其它家族受体间异源二聚化是其中的二个主要原因,因此,靶向结构上高度保守的EGFR二聚化界面有可能成为解决遗传性和获得性耐药问题的有效策略,本实验室前期采用来自EGFR二聚化界面直接参与二聚化的β-环多肽EGFR~(237-267)做抗原,构建了靶向EGFR二聚体界面的多肽疫苗和单克隆抗体,并通过体内外实验初步证明了策略的可行性。纳米抗体在大小、水溶性、稳定性和制备方面具有很大的优势,将针对异源二聚化问题和纳米抗体的特点,本研究拟利用上述抗原肽从人源化纳米抗体展示库筛选靶向EGFR二聚化界面的纳米抗体,以大肠杆菌高效表达系统建立高效制备方法,并进行相应的体外抑瘤活性研究,为进一步研发靶向EGFR二聚体界面的治疗性纳米抗体打下基础。方法:1.噬菌体展示技术筛选纳米抗体通过本实验室专利针对EGFR~(237-267)二聚化界面的这段序列委托公司合成短肽。利用合成的抗原肽作为包被氨基化酶标板的抗原,使用基于VH3-23重链片段,通过PCR突变CDR1,CDR2和CDR3区的碱基合成的具有多样性的的人源化纳米抗体库,按照噬菌体展示筛选人源化抗体片段的方法,进行三轮的噬菌体淘选,最后利用ELISA法得到靶向EGFR二聚化界面的特异性较高的纳米抗体。通过基因测序最终得到抗体基因序列。2.纳米抗体的原核表达系统的构建按大肠杆菌偏爱密码子设计目的基因序列,在在目的基因序列的前后两端分别加上NdeⅠ、HindⅢ的识别序列,并在3’端酶切位点前添加HIS-tag序列。将设计的目的基因序列委托公司合成,,克隆于大肠杆菌表达载体pET21b NdeⅠ-HindⅢ位点,以便在T7启动子驱动下高效表达。目的基因表达载体导入宿主菌E.coli ShuffleT7-B中,以实现目的蛋白可溶性表达。3.纳米抗体的表达和纯化通过降低大肠杆菌培养过程中的温度使纳米抗体能够可溶性表达,利用弱阳离子柱CM Sepharose column(10 mm×150 mm)和Ni-NTA column(10 mm×150 mm)层析的方法纯化目的产物。4.检测纳米抗体和过表达EGFR的肿瘤细胞表面特异性结合利用不同浓度的纳米抗体和不同浓度的EGF作用于EGFR过表达的人表皮癌细胞A431,利用流式细胞术检测细胞表面EGFR和纳米抗体的特异性结合。5.利用MTT法检测纳米抗体对EGFR过表达肿瘤细胞的抑制率利用MTT法对比本实验室之前制备的单克隆抗体EGFR Dimer5G9根据相对应的浓度检测纳米抗体对EGFR过表达肿瘤细胞A431(人表皮癌)和H292(人肺癌)的抑制率。结果:1.噬菌体展示技术筛选纳米抗体最终筛选到11株阳性克隆菌株,通过测序得到4个不同的V区序列的纳米抗体,其余的都与这4个V区序列完全一致。得到能够表达靶向EGFR二聚化界面的纳米抗体的4株不同的阳性克隆菌株,分别定名为EGFR dimer Nb77,EGFR dimer Nb80,EGFR dimer Nb96,EGFR dimer Nb104。2.纳米抗体的表达与纯化成功构建含有EGFR dimer Nb77和EGFR dimer Nb96重组质粒的E.coli ShuffleT7-B工程菌,并在30℃下实现可溶表达,表达产物经阳离子交换和镍柱亲和层析二步纯化,蛋白纯度达到98%以上。3.检测纳米抗体和过表达EGFR的肿瘤细胞表面特异性结合其中检测的纳米抗体EGFR dimer Nb77对A431细胞具有特异性结合,而且随着抗体浓度和EGF的浓度的增加,特异性结合越强。体现了A431肿瘤细胞对纳米抗体EGFR dimer Nb77和EGF具有浓度依赖性。4.利用MTT法检测纳米抗体对EGFR过表达肿瘤细胞的抑制率EGFR dimer Nb77对于EGFR过表达的细胞株A431和H292都具有抑制活性,而且纳米抗体EGFR dimer Nb77对于EGFR过表达的细胞株A431的抑制率随着抗体浓度的增加而增大。和单克隆抗体EGFR Dimer 5G9对比具有相同的良好的抑瘤活性。靶向EGFR二聚化界面的纳米抗体具有很好的治疗肿瘤疾病的前景。结论:以来自EGFR二聚化界面直接参与二聚化的β-环多肽EGFR~(237-267)为抗原从商品来源人源化纳米抗体库筛选到了4株EGFR二聚体界面靶向的人源化纳米抗体,并在宿主菌E.coli ShuffleT7-B中实现了其中EGFR dimer Nb77和EGFR dimer Nb96两个纳米抗体的高效可溶性表达,高度纯化的纳米抗体EGFR dimer Nb77可特异性结合于细胞表面EGFR,并显著抑制EGFR过表达肿瘤细胞的生长。
【学位授予单位】:广东药科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R945;R96
【图文】:![结构域,药科大学,细胞表面受体](http://image.cnki.net/getimage.ashx?id=1019695562.nh0004)
药科大学硕士研究生学位论文第一章 引言由四种细胞表面受体组 ErbB4 / HER。其中表 HER1 / ErbB1)是人类的生长和分化中起重要作化的细胞外结构域,单个,配体结合区在胞外结构
![过程图,二聚化,过程,药科大学](http://image.cnki.net/getimage.ashx?id=1019695562.nh0005)
广东药科大学硕士研究生学位论文埋在结构域Ⅳ中,使整个受体结构构象同源和异源二聚化。当配体与 EGFR 的结构象发生改变,二聚化臂暴露,使 EGF或异源二聚体[9-10]。导致细胞内酪氨酸通路激活有关细胞增殖、浸润等相关基因肺癌,乳腺癌,胃癌,结肠直肠癌,头R 成为抗癌药物的理想靶点之一[15-19]。
![氨基酸序列,噬菌体抗体,氨基酸序列,阳性克隆](http://image.cnki.net/getimage.ashx?id=1019695562.nh0007)
91 0.070 0.161 2.392 0.074 0.256 3.594 0.073 0.176 2.495 0.072 0.167 2.396 0.069 0.272 3.9104 0.059 0.144 2.4111 0.068 0.227 3.3.4.3 阳性克隆测序结果将 11 株阳性克隆经过测序后利用 DNAMAN 软件比对分析后得到的结果为不同的基因序列。其氨基酸序列如图 2-1,经过和网上人源化纳米抗体序列进发现其基因序列具有相同的 FR 区基本结构,故认为筛选到了 4 株能够表达 EGFR 的人源化纳米抗体的阳性克隆。其表达的纳米抗体的理化性质如表 2-
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