一种海洋芽孢杆菌胞外多糖的纯化鉴定及抗肿瘤机制研究
发布时间：2020-07-16 03:35
【摘要】：肿瘤是当今时代威胁人类健康的重大疾病,每年都有大量病人死于癌症。在所有癌症中,肺癌是发病率和死亡率都非常高的一种,且由于发病原因和病理特征的复杂性,目前为止,针对肺癌的预防和治疗,尚未有特效药。因此,寻找高效低毒的抗肿瘤特别是抗肺癌的药物迫在眉睫。海洋中有丰富的微生物资源,这些微生物能产生大量结构新型,生物活性强的天然产物,这些天然产物与陆源天然产物有很大差别,为未来新药的研发提供了有效充足的先导化合物。海洋生物多糖是近年来研究的热点,在抗炎症抗病毒抗肿瘤等多方面显示出良好的生物活性,此外,海洋生物多糖还广泛应用于食品化妆品以及辅助医疗等方面,表明海洋生物多糖具有良好的生物安全性。因此,近年来,以海洋多糖为基础的抗肿瘤药物研发吸引了越来越多人的关注。本研究从一株海洋芽孢杆菌中分离得到一种新型胞外多糖EPS11,并对该多糖的性质结构抗肿瘤活性和抗肿瘤机理进行了初步探究。研究表明,EPS11为一种杂多糖,重均分子量为22.3 kDa。单糖组成分析的结果表明,EPS11由甘露糖,氨基葡萄糖,鼠李糖,半乳糖醛酸,葡萄糖和木糖组成,其摩尔比为1:2.58:0.68:0.13:3.09:1.41。EPS11具有明显的癌细胞毒性,且对肺癌细胞作用尤为显著。当给药浓度为90 nmol/L时,在作用48 h的情况下,EPS11对A549、H1299和H460细胞的抑制率分别高达80%,67%和47%。在对EPS11抑癌机理的探究中,我们发现EPS11能显著抑制多种肺癌细胞的黏附,蛋白质组学的研究也表明,EPS11能下调细胞中多种黏附相关的蛋白质的表达。扫描电镜的结果进一步证明,EPS11的处理能破坏多种肺癌细胞表面的突出结构。且胞外突出结构的破坏程度与细胞的黏附能力表现出一定的正相关性,这表明这一结构在细胞的黏附过程中起非常重要的作用。一般细胞与基质之间失去黏附后会发生失巢凋亡,而部分癌细胞对失巢凋亡的抵抗是其转移的基础。而本研究中,EPS11不仅影响细胞的黏附还抑制A549细胞对失巢凋亡的抵抗。βⅢ-Tubulin是肺癌细胞抵抗失巢凋亡的关键蛋白。本研究证明,EPS11能时间和剂量依赖地抑制βⅢ-Tubulin相关的细胞通路。其具体表现为,(1)EPS11在转录和翻译水平上抑制了βⅢ-tubulin的表达;(2)EPS11降低了βⅢ-Tubulin下游AKT的活化。在体内实验中,EPS11也显示出良好的抑瘤活性,在2.24μmol/kg/2d的给药条件下能显著抑制小鼠体内A549细胞移植瘤的生长,抑瘤率为42.2%,同时无明显副作用。综上所述,我们认为EPS11通过破坏黏附相关的蛋白和结构抑制癌细胞的黏附,同时通过抑制βⅢ-Tubulin介导的细胞凋亡抵抗来诱导癌细胞发生凋亡。这表明EPS11可能是一种有潜力的靶肺癌治疗的天然产物。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R915
【图文】：
共发现19株菌的胞外多活性提物对Huh7.5细胞有明显的抑制作用（图3.1）。其中，编号为 BS11 的一株菌抑制率最高，其原始胞外活性粗提物作用 24h 后对 Huh7.5 的抑制率超过 90%。图 3.1 不同海洋细菌胞外活性粗提物对 Huh7.5 细胞生长的抑制Figure 3.1 Cytotoxic effects of crude extract from different marine bacteria on Huh7.5 cellline用 BS11 的胞外粗提物处理 Huh7.5 细胞 8 小时后，细胞即出现凝集和漂浮的现象。在显微镜下观察，经 BS11 胞外粗提物处理的 Huh7.5 的形态发生明显变化（图 3.2A）。用该产物处理 A549 细胞同样可以观察到细胞形态的明显变化（图 3.2 B）。
3.2 经 BS11 胞外粗提物处理后（A）Huh7.5 细胞形态的变化 （B）A549 细胞形态的变化Figure 3.2 Changes of cell morphology on (A) Huh7.5 and (B) A549 cell lines after crudeextract from BS11 treatment平板划线分离得到 BS11 的单菌落，菌落呈橘黄色，表面略粗糙。提取 BS11株的基因组，用通用引物对该菌的 16S rDNA 序列进行扩增和测序。所得序列 NCBI 网站上用 BLAST 程序进行比对，并构建进化树（图 3.3）。比对结果显示，BS11 与多株芽孢杆菌亲缘关系较近，且其中多株芽孢杆菌精确鉴定到种，结合菌落形态，初步将 BS11 鉴定为 Bacillus sp.。BS11 的 16SDNA 序列信息已上传 NCBI GenBank 数据库，其相应的 GenBank 序列号为：G597178。
图 3.3 芽孢杆菌 Bacillus sp. 11 的 16S rDNA 系统发育进化树Figure 3.3 Phylogenetic tree of Bacillus sp. 11 based on 16S rDNA sequence3.2 活性物质的发酵优化及性质确定3.2.1 发酵条件的优化对芽孢杆菌 Bacillus sp.11 的液体发酵条件进行优化，以 2216E 培养基外加1%质量分数不同种类的糖（葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、麦芽糖、半乳糖、糊精、可溶淀粉、甘油、蔗糖、乳糖）（图 3.4），不同氮源、不同培养时间、不同发酵体积进行条件优化实验。通过 MTT 发对发酵液的粗提物进行活性检测。初步实验表明，外加氮源和改变培养时间均不能明显促进活性物质的产生。在 2216E 培养基的基础上外加糖对发酵物活性的提升最明显，其次发酵时间也
本文编号：2757465
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R915
【图文】：
共发现19株菌的胞外多活性提物对Huh7.5细胞有明显的抑制作用（图3.1）。其中，编号为 BS11 的一株菌抑制率最高，其原始胞外活性粗提物作用 24h 后对 Huh7.5 的抑制率超过 90%。图 3.1 不同海洋细菌胞外活性粗提物对 Huh7.5 细胞生长的抑制Figure 3.1 Cytotoxic effects of crude extract from different marine bacteria on Huh7.5 cellline用 BS11 的胞外粗提物处理 Huh7.5 细胞 8 小时后，细胞即出现凝集和漂浮的现象。在显微镜下观察，经 BS11 胞外粗提物处理的 Huh7.5 的形态发生明显变化（图 3.2A）。用该产物处理 A549 细胞同样可以观察到细胞形态的明显变化（图 3.2 B）。
3.2 经 BS11 胞外粗提物处理后（A）Huh7.5 细胞形态的变化 （B）A549 细胞形态的变化Figure 3.2 Changes of cell morphology on (A) Huh7.5 and (B) A549 cell lines after crudeextract from BS11 treatment平板划线分离得到 BS11 的单菌落，菌落呈橘黄色，表面略粗糙。提取 BS11株的基因组，用通用引物对该菌的 16S rDNA 序列进行扩增和测序。所得序列 NCBI 网站上用 BLAST 程序进行比对，并构建进化树（图 3.3）。比对结果显示，BS11 与多株芽孢杆菌亲缘关系较近，且其中多株芽孢杆菌精确鉴定到种，结合菌落形态，初步将 BS11 鉴定为 Bacillus sp.。BS11 的 16SDNA 序列信息已上传 NCBI GenBank 数据库，其相应的 GenBank 序列号为：G597178。
图 3.3 芽孢杆菌 Bacillus sp. 11 的 16S rDNA 系统发育进化树Figure 3.3 Phylogenetic tree of Bacillus sp. 11 based on 16S rDNA sequence3.2 活性物质的发酵优化及性质确定3.2.1 发酵条件的优化对芽孢杆菌 Bacillus sp.11 的液体发酵条件进行优化，以 2216E 培养基外加1%质量分数不同种类的糖（葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、麦芽糖、半乳糖、糊精、可溶淀粉、甘油、蔗糖、乳糖）（图 3.4），不同氮源、不同培养时间、不同发酵体积进行条件优化实验。通过 MTT 发对发酵液的粗提物进行活性检测。初步实验表明，外加氮源和改变培养时间均不能明显促进活性物质的产生。在 2216E 培养基的基础上外加糖对发酵物活性的提升最明显，其次发酵时间也
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
1 卢今;伍长娟;陈礼明;杨肖琳;金涌;;国产与进口紫杉醇注射液在小鼠体内药动学比较[J];中国医院药学杂志;2010年16期
2 周庆峰;李明月;那广水;李成伟;;海洋生物多糖抗肿瘤作用机制的研究进展[J];中国药理学通报;2009年08期
3 吴梧桐,王友同,吴文俊;海洋活性物质研究若干进展[J];药物生物技术;2000年03期
4 管华诗,耿美玉,王长云;21世纪,中国的海洋药物[J];中国海洋药物;2000年04期
本文编号：2757465
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yiyaoxuelunwen/2757465.html
最近更新
教材专著
