紫草素衍生物：设计、合成及抗肿瘤机制

发布时间：2020-07-24 05:15

【摘要】：紫草素的药理作用广泛,具有抗炎,抗病毒和抗氧化等作用,尤其是具有良好的抗癌作用,并且这些作用引起了大家的广泛关注。然而,因为它具有相对副作用和毒性,其潜在的效用是有限的。为了开发具有高效和低毒性的分子,本课题以紫草素为母核设计和合成21个靶向PI3K的紫草素衍生物,所有合成的化合物已通过~1H-NMR、~(13)C-NMR和HR-MS验证。首先通过MTT实验在人胃癌细胞(SGC-7901),人胃癌细胞(MGC-803),人肝癌细胞(SMMC-7721),人胶质瘤细胞(U-87),人正常肝细胞(L-02)上对21个紫草素衍生物进行初步活性评价,结果显示化合物4s在人胃癌细胞SGC-7901更具研究意义,因此我们开展了一系列对化合物4s抗肿瘤的机制研究。我们通过集落克隆实验和细胞周期实验进一步研究化合物4s对细胞增殖的作用;AnnexinV/PI双染法和蛋白印迹法检测化合物4s是否诱导细胞发生了凋亡;吖啶橙染色法、GFP-LC3转染法、免疫荧光法和蛋白印迹实验研究细胞自噬;然后通过AnnexinV/PI双染法检和蛋白印迹法探讨细胞自噬在化合物4s促细胞凋亡作用中所起的作用;最后Western blot实验检测化合物4s对磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路的影响,进一步通过分子对接去研究化合物是否与PI3K蛋白有作用。实验结果显示集落形成率随化合物4s浓度增大而降低,细胞增殖被抑制;化合物4s将细胞阻滞在G1期的比例呈浓度依赖性增加,细胞增殖被抑制与被阻滞在G1期有关;化合物4s在SGC-7901上的凋亡率随浓度增大(1,2,4μM)而增加,凋亡相关蛋白Bax和cl-PARP水平上调、Bcl-2及PARP下调,表明化合物4s诱导细胞凋亡,被阻滞在G1期的细胞发生了凋亡;自噬溶酶体和LC3蛋白的增加说明细胞自噬的发生;当化合物与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)共孵育时,细胞凋亡率受到抑制,说明自噬在化合物4s的细胞凋亡作用中起促进作用;化合物4s通过PI3K/AKT/mTOR负调控细胞自噬。初步机制表明,化合物4s可通过抑制PI3K/AKT/mTOR途以自噬依赖性方式介导细胞凋亡。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914;R96
【图文】：

我们通过反向找靶来寻找紫草素的靶点(图2)，发现了抗肿瘤过程中重要的靶点 PI3K(PDB:2CHW)[32]。将 PIK39 与 PI3Kγ对接，如图 3 显示 Val-882 和 Glu-880 分别与嘧啶环上的 N 和咪唑环上的 NH 形成氢键相互作用。Lys-802，Pro-810 和 Met-804 等多个氨基酸残基与苯并嘧啶酮上的苯环发生疏水相互作用，此外，Met-804 和 Met-953 残基上的 S 原子分别与吡啶酮和嘧啶环形成 Pi-S 相互作用。Trp-812 与苯环形成 Pi-δ相互作用。Tyr-867，Phe-961与咪唑环形成 Pi-Pi 相互作用。为了合成基于紫草素母核的新型 PI3K 抑制剂，我们设计出了一系列的紫草素衍生物。将紫草素衍生物与 PI3K（PDB:2CHW）进行对接，发现它们具有较低的相互作用能，并且优于 PIK39 和紫草素（表 1）。因此

对 HL60 和 K562 细胞系具有很强的抗癌活性[29]。Rao 发现β-羟基异戊酰紫草素（图1，3）对人前列腺癌细胞 DU-145 具有很强的抑制作用和选择性毒性[30]。此外，研究人员还发现异戊酰紫草素（图 1，4）和 SH-7（图 1）对白血病 HL-60 细胞和A549 细胞均有明显的抑制作用，诱导细胞凋亡，并且两种化合物均强于紫草素[31]。为了合成更高效低毒的紫草素衍生物，我们通过反向找靶来寻找紫草素的靶点(图2)，发现了抗肿瘤过程中重要的靶点 PI3K(PDB:2CHW)[32]。将 PIK39 与 PI3Kγ对接，如图 3 显示 Val-882 和 Glu-880 分别与嘧啶环上的 N 和咪唑环上的 NH 形成氢键相互作用。Lys-802

图 3. PIK39 与 PI3Kγ对接的结果Figure 3. The docking results of PIK39 and PI3Kγ表 1 代表性的紫草素衍生物骨架结构虚拟筛选的结果。Table 1. Representative shikonin skeleton structures through virtual screening.Compounds -CDOCKER INTERACTION ENERGY (kcal/mol)53.0399

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本文编号：2768374