基于FtsZ靶标的新型芳基唑类苯甲酰胺抗菌先导物的发现及相关活性研究

发布时间：2020-07-24 07:13

【摘要】：由细菌引起的感染一直以来都是威胁人类健康的一大常见及多发性疾病,严重的情况下甚至危及患者生命安全。随着1928年青霉素的发现及后续多种抗菌药物的应用,数千万的生命得以救治,为保障人类健康立下了不可磨灭的功绩。然而,抗菌药物的使用不可避免地会导致细菌耐药性的产生,尤其是近些年来抗菌药物的大范围使用甚至滥用,使得细菌产生耐药性的时间大大缩短,然而对新型抗菌药物的研发却远远赶不上这一速度。如今日益严重的细菌耐药性无疑加剧了临床感染的威胁,我们担心不久的将来,面对多药耐药菌,将无一抗菌药物对其有效,人类将重新回到20世纪前的无青霉素年代。物竞天择,适者生存。细菌因抗菌药物的出现进化出耐药性,因此,规范合理的使用抗菌药物可减小细菌的进化压力从而减缓细菌耐药性的产生。此外,抗菌新靶点的发现及其有效药物的研发也将是回击耐药性细菌的一种更加直接有效的手段。丝状温度敏感蛋白Z(FtsZ)是参与细菌细胞分裂的一种关键蛋白,干预其正常的生物学功能将导致细菌分裂受阻,最终使细菌死亡。因此FtsZ可作为一个抗菌药物研发非常有前景的新靶点,并且已报道的多种FtsZ抑制剂显示出了优良的抗菌活性。其中,由3-甲氧基苯甲酰胺(3-MBA)修饰而来的2,6-二氟苯甲酰胺衍生物是一类非常有代表性的FtsZ抑制剂,其相关靶向作用、分子机制、体内外生物活性、蛋白共晶结构等均有不同程度的研究报道,因此受到世界范围内抗菌研发机构的广泛关注。但目前此类化合物仅处于临床前研究当中,对其结构进一步的优化筛选及开发仍具有重要意义。有鉴于此,我们以3-MBA类似物为起点,通过基于结构的合理药物设计以及计算机辅助药物设计,对此类化合物进行了多轮广泛且细致的结构筛选及优化,设计并合成了 21个系列共计182个化合物,后续对其体内外抗菌活性、细菌形态、蛋白靶向作用、生物稳定性等进行了评价。之前的研究发现,苯甲酰胺类FtsZ抑制剂结构中的甲酰胺键对蛋白结合力及抗菌活性贡献极大,因此针对其关键药效团甲酰胺进行结构改造,对研究该类型化合物与FtsZ蛋白间的相互作用及结合模式、探索新的结构类型的抗菌药物具有重要意义。我们通过生物电子等排策略,将甲酰胺替换为三氮唑、VA二唑、酰肼、脲等结构,设计合成了 A至K十一个系列共52个化合物。经过体外活性筛选,我们发现其中以1H-1,2,3-三氮唑替换后的衍生物B6具有较好的抗菌活性,对所测四种革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、敏感及耐药的金黄色葡萄球菌)的MIC在24 μg/mL之间。然而其甲酰胺结构的母体化合物活性仅为16 μg/mL。说明1,2,3-三氮唑在该系列结构中相较于甲酰胺表现出更强的抗菌活性,为开发新颖结构的抗菌药物提供了优质先导物。靶向FtsZ的药物都能造成细菌形态变大或延长,然而对B6进行的靶向测试结果发现,B6并不造成细菌形态的显著变化;并且B系列苯基三氮唑类的构效关系也与苯甲酿胺类的研究结论不符。因此我们推断,该系列化合物虽然具有较好的抗菌活性,但其作用靶点可能不是FtsZ。为此我们进一步对其潜在作用靶蛋白进行了研究探索。经PharmMapper系统搜索预测,肽脱甲酰基酶(PDF)可能是其潜在作用靶点。后续又经LigsitCSC系统预测该蛋白的潜在结合口袋,以及计算机对接分析,发现B6能与PDF的结合位点生产较强的相互作用,1,2,3-三氮唑及醚氧原子与周围氨基酸残基形成氢键作用,烷基长链则与疏水区域相互作用。该结合模式能够很好的解释B系列的构效关系,推测该类苯基三氮唑结构的衍生物通过作用于PDF发挥抗菌活性,为进一步探索先导物B6的作用机制提供了初步的研究方向。替换甲酰胺导致脱靶效应后,我们便保留甲酰胺结构,对其3位亲脂性侧链进行结构探索和修饰。以苯甲酰胺、3位串联芳环的药效团为结构基础,将异VA唑五元杂环引入到中间连接环,设计合成了 3-芳基异VA唑-苯甲酰胺类衍生物,即系列L共计35个化合物。针对L系列化合物的活性筛选发现L25活性较好,对其进行分子对接分析发现,其结构中的异VA唑环附近的Asp199氨基酸残基可能是一个潜在的结合位点。通过计算环上N、O原子与该氨基酸游离羧基的距离,推测将N、O原子的位置交换之后,N原子距离Asp199羧基3.4A,两者间可能形成离子偶极相互作用。由此设计了含有5-芳基异VA唑-苯甲酰胺类M系列共计21个化合物,即L系列中异VA唑环上N、O位置互换的衍生物。对该系列的化合物活性测试发现,化合物M14,即L25中异VA唑环上N、O互换衍生物,具有比L25更好的抗菌活性,对两株杆菌(枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)的MIC从0.03、0.25 μg/mL降低至0.015、0.03 μg/mL,活性提高了2-8倍;对三株金黄色葡萄球菌(敏感、耐青霉素、耐甲氧西林)的MIC从8、4、8 μg/mL降低至2、2、4μg/mL,活性提高了24倍。通过计算机模拟对接分析,M14中异VA唑环上的N原子的确与Asp199氨基酸残基产生了额外的相互作用;在FtsZ蛋白聚合实验中,相同浓度的M14,相较于L25,能对FtsZ产生更强的聚合促进作用,表明M14与FtsZ的结合作用更强。随后在小鼠血液感染模型实验中,M14表现出了较好的体内抗菌活性,150 mg/kg分五次腹腔注射给药能够显著降低小鼠血液中的菌量。M14针对哺乳动物Hela细胞系的IC50大于128 μg/mL,远高于其抗菌浓度,这也间接表明M14对哺乳动物微管蛋白无抑制作用。随后进一步对中间连接环进行结构探索和优化,设计了含有1,3,4-VA二唑-2-酮的N至S六个系列共计44个化合物。对系列中化合物的活性研究发现N14对四种金黄色葡萄球菌,包括三种耐药菌的活性在0.5-1 μg/mL之间,为该系列活性最好化合物。而互换1,3,4-VA二唑-2-酮五元环两侧的药效团取代位置得到Q系列化合物,将使抗菌活性消失,说明中间五元杂环与蛋白的靶位点有着特异性的适配。分子中引入一个亚甲基以延长分子长度及柔性得到O、P系列化合物,也将导致抗菌活性降低,这可能与靶点的结合口袋空间限制有关。但亚甲基引入的位置对活性影响的程度并不相同,引入到-O-C-桥上形成-O-C-C-桥后活性降低程度较小,推测与三个原子链的柔性及可伸缩性有关。出于对1,3,4-VA二唑-2-酮环中内酯键潜在生物稳定性问题的考虑,我们设计了将环中O原子替换为N、C原子的R、S系列衍生物。体外血浆稳定性实验表明该设计策略极大的提高了分子生物稳定性,化合物R1经24小时后含量几乎不变,而N14的血浆半衰期仅为2.5小时。但1,3,4-VA二唑-2酮环中O原子替换为N、C后的系列化合物抗菌活性均消失,通过计算发现N14的Log P值为3.41,其环上O替换为N、C后的衍生物R1、S2的Log P分别为2.74、2.69,极性明显变大。因FtsZ在该结合位点为一疏水性空腔,推测R、S系列化合物抗菌活性消失主要是由亲脂性降低及空间体积效应引起的。T、U两个系列共计30个化合物在分子构像上做了较大改动,将L、M系列中的异VA唑环改为异VA唑啉环。环中碳碳双键到碳碳单键的替换使环上产生一个手性碳,并造成与之相连部分的非共面结构,整个分子的构象更加灵活多变,以研究探索该类弯曲构型的分子与蛋白的诱导契合结合模式。对此系列化合物的活性筛选发现T16具有最强抗菌活性,对包括三种耐药菌在内的四种金黄色葡萄球菌抗菌活性在0.25-0.5 μg/mL之间,优于对照品PC190723及临床药物利奈唑胺、环丙沙星、红霉素,为本课题设计合成的所有系列中活性最好化合物。由于T16为外消旋体,推测其R或S构型的单一纯品抗菌活性会更好。T16-R、T16-S与FtsZ的分子对接结果显示,两者的结合模式几乎重叠;对接分数显示R构型结合力稍高于S构型。与PC190723-FtsZ共晶中呈平面状的结合模式不同,T16分子以一种类似“M”型构象结合于靶位点,这与我们设计的初衷相符。在诱导契合结合作用模式下,这种略微弯曲的分子结构可能与结合口袋凹凸不平的氨基酸残基表面更加适配,形成互补的“锁钥模型”,因而使得其抗菌活性较好于PC190723。初步的细胞毒性实验表明,该外消旋体T16对哺乳动物Hela细胞几乎无毒性作用,IC5564 μg/mL,远高于其抑菌浓度。后续的对应异构体拆分及活性毒性方面的特性应进一步被研究探索,以确定其临床应用前景。通过设计合成以上二十一个系列共计182个化合物,并对其进行初步的生物活性评价,我们发现结构中分别含有4-叔丁基苯基异VA唑、4-溴苯基VA二唑酮、4-正丁基苯基异VA唑啉结构的M14、N14、T16三个苯甲酰胺衍生物具有最好的抗菌活性。构效分析发现,上述活性突出的化合物分子结构末端都为苯环,且苯环上普遍连有烷基链或是卤素等亲脂性取代基,这与FtsZ蛋白在该结合区域大多为疏水性氨基酸残基有关。中间杂环左侧连接的苯甲酰胺活性必须基团与靶蛋白形成主要的氢键作用力,右侧连接的取代芳环与靶蛋白的疏水性区域相互作用,表面上看中间五元杂环只起到连接左右两部分药效团的作用,但实际上中间五元杂环的空间体积及结构特征对活性有重要影响。例如其环上取代基大小、环上杂原子的组成,不仅对靶位点的结合起着重要作用,而且能够影响到整个分子的生物稳定性及药代动力学性质。尤其是左右两侧的药效团结构及性质已基本确定、改造空间有限的情况下,对于中间连接环的结构改造仍有很大的余地,这也将是进一步提高抗菌活性并改善整个分子成药性的重要优化部位。我们在本研究当中以苯甲酰胺类FtsZ抑制剂为结构基础,依据生物电子等排原理、基于结构的骨架优化、计算机辅药物设计等策略设计合成了多个系列的衍生物,并从中发现了多个抗菌活性突出的先导物,在体内、体外及靶蛋白水平都体现出较好的活性。本研究中众多骨架多样性的活性分子不仅为研究苯甲酰胺类抑制剂与FtsZ靶蛋白的作用方式、设计靶向FtsZ的抗菌化合物提供了可靠的结构数据,并为进一步的生物活性及成药性优化、开发结构新颖、作用机制独特的新一代抗菌药物提供了高质量的先导物,以对抗全球日益严峻的耐药菌问题。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914


本文编号：2768498