可循环磁性双功能生物催化剂的构建及用于手性醇的合成

发布时间：2020-07-27 16:29

【摘要】：(R)-3-奎宁醇是合成瑞伐托酯、阿地溴铵和索利那新等手性药物的重要中间体。生物催化法因具有反应条件温和、环境友好、选择性高等优点而被用于(R)-3-奎宁醇的合成。常规酶偶联方法催化不对称合成(R)-3-奎宁醇时,羰基还原和辅酶再生过程分别在不同的菌体中进行,底物、产物和辅酶须在细胞间、细胞内外进行交换/扩散,导致生物转化时间延长,效率低,不利于工业化。针对酶偶联方法的缺陷,本课题拟用基因重组和蛋白质工程技术构建一种具有双活性中心、双功能的融合体酶,实现羰基不对称还原和辅酶原位再生同时进行,继而循环使用,以提高生物转化效率。利用亲和固定化技术,构建一种高效、可循环再利用的磁性双功能生物催化剂,建立高效生物催化不对称合成(R)-3-奎宁醇的绿色新工艺。具体内容如下:1.构建双功能融合酶表达载体及诱导目标酶表达。通过基因重组技术将编码羰基还原酶(Ml QR)和辅酶再生酶(GDH)的两个全长基因序列通过柔性连接子连接,全合成编码具有羰基还原和辅酶再生的双功能融合酶(MLG)的全长基因片段。再将mlg基因片段连接到载体pET28a,形成重组表达质粒pET28a-mlg。质粒转化感受态细胞,优化的酶表达条件:16℃、0.2 mM IPTG、诱导表达36 h,能可溶性高表达高活性的双功能融合酶(MLG)。MS确证MLG的氨基酸序列与蛋白质数据库中氨基酸序列匹配良好。MLG中羰基还原活性为3678U/g,辅酶再生活性为5070 U/g。MLG动力学分析显示:对底物3-奎宁酮的K_m值为12.06 mM,K_(cat)/K_m为0.39;对底物葡萄糖的K_m值为1.62 mM,K_(cat)/K_m为6.08。2.重组全细胞催化不对称合成(R)-3-奎宁醇。优化的生物转化条件为:30℃、pH 7-8、0.2 mM辅酶、葡萄糖(1.5倍底物当量)、底物/重组细胞质量比为24:1。当底物3-奎宁酮载量为486 g L~(-1)时,生物转化时间为5.5 h,GC测定转化率为100%,收率90%,ee值100%,时空产率1505.5 g L~-11 d~(-1)。3.可循环磁性双功能生物催化剂的构建。利用共沉淀法合成磁性Fe_3O_4纳米粒,通过硅烷将螯合剂NTA偶联到磁性纳米粒表面,经Ni~(2+)功能化形成亲和纳米磁珠。基于Ni~(2+)亲和作用固定组氨酸标记的双功能融合酶,形成可循环再利用的磁性双功能生物催化剂。借助马尔文粒度仪、SEM、红外光谱仪、热重分析仪、X-衍射仪、磁性能分析仪等手段表征磁性双功能生物催化剂。粒径约20-40 nm;饱和磁化强度为38.96 emu/g,为超顺磁性。磁性双功能生物催化剂中羰基还原(MlQR)活性为2866 U/g,辅酶再生(GDH)活力为6195 U/g。磁性双功能生物催化剂的酶载量为70.6 mg/g,其中羰基还原和辅酶再生酶活性回收率分别为77.99%、122.18%。4.磁性双功能生物催化剂在合成(R)-3-奎宁醇中的应用。优化的生物转化条件为:30℃,pH 8.0左右,辅酶0.2 mM,葡萄糖(底物的1.5倍摩尔当量)、生物催化剂与底物质量比为1:70,生物转化时间为5.5 h,GC测定转化率为100%,产率90%,ee值100%。按生物催化剂与底物质量比1:40启动生物转化反应,磁性双功能生物催化剂可循环使用11次,每克磁性催化剂可获得产物的相对产量达到312.37g。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R914
【图文】：

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用于手性醇的合成前言对称氢化还原潜手性酮是制备手性仲醇最直接、最有效方法之一[1]。手种重要的手性砌块，是各种手性药物、香料、农用化学品、天然产品的单元[2-5]。(R)-3-奎宁醇(图 1a)是合成临床上许多重要手性药物的关键性如治疗慢性阻塞性肺疾病的阿地溴铵(图 1b)和瑞伐托酯[6](图 1c)、改善症引发的尿频、尿急和尿失禁症的索利那新[7](图 1d)、治疗阿尔茨海默利定(图 1e)[8]和乙酰胆碱酯酶抑制剂(图 1f 和 g)。

奎宁,不对称还原

图 2. 酶偶联催化不对称还原合成(R)-3-奎宁醇tric reduction synthesis of (R)-3-quinuclidinol by enzyme-coup第二个酶和提高反应催化效率，可采用基因工程技术通过连接子连接，构建一种具有双活性中心的单链多还原与辅酶再生同时进行的设想(图 3)。如 Iturrate 等ase/激酶融合酶，该酶具有较好的生物催化活性，与原倍。Daniel 等[24]将拜耳-维利格单氧酶与亚磷酸脱氢酶能酶实现了辅助因子高效再生。

融合酶,辅酶再生,双功能,生物转化

【参考文献】