双功能肽的设计、合成和制备及其抗阿尔兹海默症作用研究

发布时间：2020-07-28 21:04

【摘要】：阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)又被称为老年痴呆,是一种隐匿、持续发展的神经退行性疾病。AD主要在老年人中发病,病情恶化程度随时间延长而加重,病人会逐步丧失全部记忆、自理能力和行动能力,最终走向死亡。目前,AD已经成为威胁全世界65岁以上老年人生命的第五类致死性疾病。因此,对于AD的研究及抗AD的药物的开发是十分必要且紧迫的。对于AD具体的发病原因和机制至今尚不明确,其中以淀粉样蛋白级联假说机制和氧化损伤机制最为广泛被学者认可。Aβ的产生和清除失衡导致过其多在脑组织中聚集和沉积,而Aβ的大量产生、异常聚集和神经细胞外沉积会对神经细胞产生毒性,这种毒性可以使大脑皮层内发生复杂的级联变化,如突触丧失、炎症级联反应、氧化压力、胞内离子通道破坏、PHF并最终导致神经细胞损伤死亡,最终引发AD。目前对于单一靶点抗AD的药物研究进展并不理想,多靶点药物的开发成为抗AD的热点研究方向。本实验室前期实验研究中根据抗坏血酸过氧化物酶的主体结构、微过氧化物酶MP-9的结构、以亚血红素为靶分子筛选噬菌体展示肽库所得到的序列,设计了一种含His的过氧化物酶模拟酶次血红素六肽(Deuterohemin-AlaHisThrValGluLys,DhHP-6),具有较高的过氧化物酶活力,在体内具有清除自由基、抗氧化的作用。文献报道iAβ5p(LPFFD)是经过改造的β片层断裂肽(BSBp),能够结合到Aβ_(1-42)的核心疏水区域进而破坏β-片层结构的形成,从而阻止Aβ_(1-42)聚集。因此,本论文拟通过抑制Aβ_(1-42)聚集和抗氧化应激两个靶点来设计合成一条具有拟过氧化物酶-抑制Aβ_(1-42)聚集的双功能肽(BP,Dh-βAlaHisThrValGluLysLeuProPhe Phe Asp),即以共价连接的形式将β片层断裂肽iAβ5p连接在过氧化物酶DhHP-6上。利用固相肽合成法合成BP后,通过在体外测定其过氧化物酶活力,清除自由基能力;在蛋白水平检测其与Aβ_(1-42)相互作用,构建并利用AD细胞模型SH-SY5Y细胞测定其在体外抗AD作用效果,并以过表达人源Aβ_(1-42)突变体秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)CL4176线虫作为动物模型,测定对线虫寿命和瘫痪率的影响,并通过Aβ_(1-42)斑块沉积、ROS含量以及Aβ_(1-42)和hspmRNA表达水平探究其抗AD的作用机制。本论文首先通过Fmoc固相肽合成法合成BP,经MALDI-TOF-MS确定相对分子质量为1848,确认为目标产物,通过HPLC制备BP纯品0.997g,收率为53.95%;通过维生素C和H_2O_2双底物法测定BP酶活力为20.8U/mg,为DhHP-6的38.3%,并通过DPPH自由基清除法,证明BP具有抗氧化的作用,0.9μM BP即可达到50%DPPH清除率;通过生物大分子相互作用系统(BLI)证明BP具有与Aβ_(1-42)亲和作用,KD值为9.07,并通过Tris-Tricine-SDS实验和ThT荧光染色实验,证明BP在体外具有抑制Aβ_(1-42)聚集成寡聚体和β淀粉样蛋白成熟体即β片层纤维的作用;利用40μM Aβ_(25-35)在37℃温育24h后诱导细胞损伤,细胞存活率为67.73%,成功建立阿尔兹海默症细胞模型,并通过MTT法证明,BP在体外细胞模型中具有Aβ_(1-42)损伤保护作用,15μMBP实验组细胞存活率达到85.13%;通过AD模型突变体线虫CL4176,证明BP能够延缓由Aβ_(1-42)表达产生而引起的线虫瘫痪和死亡,其抗Aβ_(1-42)损伤作用是通过减少抑制Aβ_(1-42)聚集形成的斑块沉积和抗氧化清除ROS的方式,同时上调分子伴侣hsp16.2、hsp16.41和hsp12.6表达帮助Aβ_(1-42)正确折叠。综上所述,BP具有抗氧化作用,能够提高抵抗Aβ_(1-42)诱导的氧化损伤能力;又具有β片层断裂肽作用,能够阻止Aβ_(1-42)的产生和聚集,使Aβ_(1-42)正确折叠来减少Aβ_(1-42)斑块沉积,防止其对神经细胞的进一步损伤,双靶点协同发挥抗AD的作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914;R96
【图文】：

核磁共振,健康人,大脑,认知功能障碍

[10]，该病已经成为威胁全世界 65 岁以上老年人生因此，AD 的研究和治疗已经迫在眉睫，同时抗 A和开发是十分必要且紧迫的。理特征神经病理学特征病理损伤主要集中在大脑皮质和某些皮层下区域。、沟回增宽、脑室扩大，其中颞叶、顶叶以及额层下区域会出现广泛的神经元和突触的丢失、损着类似的变性[13]。同时，通过核磁共振和 PET-C从轻度认知功能障碍到最终发病的过程中，AD 域体积缩小的特点[15]。

健康人,神经细胞,假说,学说

图 1.2 健康人与 AD 患者的神经细胞D 作用机制假说 AD 具体的发病机制至今尚不明确，但能够确定有 1%~5%的有关[21]。基于对 AD 的多年研究，目前形成五种被广泛认可别是 β-淀粉样蛋白级联假说机制，氧化应激损伤学说，胆碱微管 Tau 蛋白异常学说和早老基因突变学说。其中影响力最文主要依据的假说为淀粉级联假说（Amyloid cascade hypothe 淀粉样蛋白级联机制假说样蛋白（β-Amyloid，Aβ）于 1984 年由 Glenner 和 Wong 确定 Aβ 是由 39～43 个氨基酸所组成的具有折叠构型的多肽

示意图,示意图,水片,物质

第一章前言Aβ 是 APP 经由β蛋白水解酶和 γ 蛋白水解酶依次水片段，在人体内主要包括 Aβ1-40和 Aβ1-42两种形式[24]。其始物质和主要结构物质，在人体内对神经细胞具有明显众认为是 AD 早期触发因素[25]。

【参考文献】