抗乙肝药物的体外筛选及机制研究

发布时间：2020-08-07 21:30

【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是嗜肝性DNA病毒,HBV感染可引起急性或慢性的病毒性肝炎,从而可发生肝脏的纤维化、肝硬化甚至是肝细胞癌症。目前临床上广泛应用的抗HBV的药物主要有免疫调节剂和核苷类似物。抑制病毒是目前治疗慢性乙型肝炎的重要手段,其中占首位的药物有干扰素类和核苷(酸)类似物(NAs)。干扰素可以通过抗病毒、免疫调控的机理治疗慢性肝炎(CHB)。它具有持续反应率高、疗效稳定、治疗过程相对稳定、无耐药性等优点。但是干扰素治疗效果很一般,初期常伴有一定时期的流感样症状,能引发骨髓抑制、肝脏损害等不良反应,对于肝功能近于失代偿或已经发生的患者会产生严重的后果。另外干扰素使用不便,通常为皮下注射,且对于免疫功能不全的患者不适用。因此,干扰素的临床应用受到很大限制。核苷类似物口服给药方便生物利用度高、抗病毒作用较强,不依赖患者对HBV的免疫反应,故而不良反应少而比较轻,可用于肝功能失代偿者,因此在临床上应用广泛,但核苷类似物不能彻底清除体内病毒,需要持久应用,容易发生耐药性。本课题旨在研究10种中药化合物体外抗乙肝病毒活性及其作用机制,为寻找新型抗乙肝病毒药物奠定基础。方法:本课题采用HepG2.2.15和HepGRL1细胞为模型选出10种化合物体外抑制HBV作用及对HBV X基因相关机制的初步探讨,实验分为两部分,内容如下:第一部分10种化合物抗HBV作用的体外筛选(1)药物的细胞毒性检测:HepG2.2.15和HepGRL1细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后,加入所配不同浓度含药培养液,继续培养3天,第三天MTT法检测化合物对于细胞的毒性。(2)药物对HBV e抗原和s抗原抑制的检测:HepG2.2.15和HepGRL1细胞在96孔细胞培养板中培养24小时后,加入所配不同浓度含药培养液,继续培养6天(每3天换液一次),收集6天的上清液,用ELISA方法检测样品对HBV s抗原和e抗原的表达量。(3)药物对HBV病毒DNA抑制检测:HepG2.2.15和HepGRL1细胞在24孔细胞培养板中培养24小时后,加入所配不同浓度含药培养液,继续培养6天(每3天换液一次),收集上清液和细胞,用FQ-PCR法检测化合物对细胞内外HBV DNA的影响。第二部分10种化合物抗HBV X基因相关机制的初步研究RT-PCR法检测化合物对HepG2.2.15细胞和HepGRL1细胞HBV X基因表达水平。HepG2.2.15和HepGRL1细胞在12孔细胞培养板中培养24小时后,加入所配不同浓度含化合物的培养液,阳性对照组用3-TC和ETV,空白组只加入培养基,继续培养6天(每3天换液一次),收集细胞提取RNA并反转,用RT-PCR法检测化合物对细胞内HBV X基因表达的影响。结果:第一部分10种化合物抗HBV作用的体外筛选(1)10种不同的化合物分别作用HepG2.2.15细胞和HepGRL1细胞,MTT法分别测出化合物对于两种细胞的毒性计算出TC_(50)。(2)Elisa法检测化合物对于两种细胞的HBV e抗原和s抗原表达量的影响发现,yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a、yxy1403b对HepG2.2.15细胞HBV e抗原和s抗原具有较强的抑制作用,另外yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a、yxy1403b对HepGRL1细胞的HBV e抗原具有较强的抑制作用。(3)用Q-PCR法检测10种化合物对HepG2.2.15细胞和HepGRL1细胞上清及细胞内HBV DNA分泌的影响,发现yxy1741、yxy1483e、yxy1483c显著性抑制HBV DNA复制,并且与空白组相比,抑制率超过50%,且该化合物显著性抑制HBeAg、HBsAg水平。第二部分10种化合物抗HBV X基因相关机制的初步研究RT-PCR结果显示yxy1483e不但对两种细胞HBV e抗原和HBV s抗原和HBV DNA有一定抑制作用,而且能抑制细胞中HBV-X RNA的表达。结论:通过本研究表明,在HepG2.2.15细胞和HepGRL1细胞培养实验中,yxy1483e能明显抑制体外HBV DNA复制,同时能对HBsAg和HBeAg表达也有较强的抑制作用,且细胞毒性较小,对HBV-X RNA的表达有抑制作用,将有可能发展为新一种的抗HBV的药物。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965.1
【图文】：

yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a和yxy1403b对野生型HBV细胞株HepG2.2.15作用6天的抑制的率

yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a和yxy1403b对拉米夫定耐药HBV细胞株HepGRL1HBeAg的抑制作用（与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，与阳性对照组相比，□P<0.05，□□P<0.01）

几种化合物对HBV细胞株Hep2.2.15HBV-X基因表达的影响

【参考文献】

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本文编号：2784552