苦味受体在大鼠心脏的表达及其对心脏生理功能的调节作用和机制研究

发布时间：2020-08-08 00:08

【摘要】：研究背景:G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)是细胞膜上的一种7次跨膜受体,能将细胞外刺激转化为细胞内信号。GPCR参与生物体内多种重要的生理过程,也是重要的药物靶点。苦味受体(bitter taste receptors,TAS2Rs)属于G蛋白偶联受体家族的一员,可以介导舌头上味蕾细胞的苦味感知过程。最近有文献报道TAS2Rs不仅在气管、胃肠道、子宫、膀胱等器官表达,而且具有其特定的生理功能。然而,TAS2Rs在心血管系统的生理和药理学研究鲜有报道。目前,仅有文献报道集中在:TAS2Rs在人和啮齿类动物的心脏表达;TAS2Rs与心脏的代谢和营养传感(nutrient-sensing)相关,并且介导G蛋白依赖的左心室压和主动脉压的降低。因此,TAS2Rs在心脏左心室的表达、功能及信号转导通路亟待研究。研究目标:明确TAS2Rs在大鼠心脏左心室的mRNA表达水平;阐明TAS2Rs对大鼠心脏功能的影响及苦味化合物调节心肌收缩的机制。研究方法:利用qPCR实验检测大鼠左心室心肌组织和心肌细胞中TAS2Rs亚型的mRNA表达水平;利用Langendorff离体心脏灌流实验,从离体心脏水平研究苦味化合物(苯甲地那铵、奎宁和氯喹)对大鼠心脏功能的影响,检测指标为心率、心电图(electrocardiogram,ECG)和左心室舒缩功能等;利用离体组织浴槽实验从左心室心肌组织水平,研究预先给予电刺激(electrical field stimulation,EFS,1 Hz-5 V)或肾上腺素刺激后,苦味化合物(苯甲地那铵、奎宁和氯喹)对大鼠心肌收缩功能的影响;钙火花是钙信号的基本单元,是心肌细胞肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)上钙释放通道自发开放或由L-型Ca~(2+)离子通道开放进一步触发引起的局部钙释放事件,是心肌兴奋-收缩耦联的基本单位。在以上功能性实验的基础上,利用激光共聚焦实验研究三种苦味化合物对大鼠心室肌细胞内钙火花释放频率的影响,阐明苦味化合物通过激活TAS2Rs降低心肌收缩的机制。研究结果:大鼠左心室表达6种TAS2Rs亚型,分别为TAS2R108、TAS2R120、TAS2R121、TAS2R126、TAS2R135和TAS2R143。其中TAS2R120表达水平最高,TAS2R108表达水平最低。在大鼠离体心脏水平,苦味化合物苯甲地那铵(0.1-2μM)、奎宁(1-100μM)和氯喹(1-100μM)灌流后可显著降低大鼠心率(P0.05)。苯甲地那铵和奎宁可显著增加大鼠离体心电图QRS波群的传导时间(P0.05),表明TAS2Rs的激活可延长心脏传导时程。其中,三种苦味化合物均可增加左心室收缩期(systolic duration)和舒张期(diastolic duration)(P0.05)。苯甲地那铵和氯喹均可降低左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)(P0.05)。奎宁对+dp/dtmax和-dp/dtmax无显著影响。氯喹显著降低左心室发展压(left ventricular developed pressure,LVDP)(P0.05)。50μM的奎宁显著增加LVDP,当浓度达到100μM时,LVDP迅速降低(P0.05)。苯甲地那铵对LVDP无显著影响(P0.05)。在组织水平上,系列浓度的苯甲地那铵(10-200μM)、奎宁(10-300μM)和氯喹(10-200μM)可显著减弱电刺激诱导的心肌收缩(P0.05)。结果表明,单一浓度(20μM、50μM、100μM、200μM)的苯甲地那铵和奎宁可完全抑制肾上腺素诱导的收缩,其中高浓度(100μM、200μM)的苯甲地那铵和奎宁抑制速度比低浓度(20μM、50μM)快且抑制彻底;500μM的氯喹对肾上腺素诱导的收缩有迅速的抑制作用,随后这种抑制作用在57.8±21.9 s后消失。这些结果表明TAS2Rs的激活可显著降低EFS和肾上腺素诱导的心肌收缩。随后,利用L-型钙离子通道抑制剂硝苯地平(nifedipine)、雷尼丁受体(ryanodine receptors)抑制剂丁卡因(tetracaine)、β肾上腺素受体抑制剂普萘洛尔(propranolol)和无钙缓冲液,探究苦味化合物降低EFS诱导大鼠心肌收缩的机制。结果表明,EFS增加心肌细胞表面L-型钙离子通道的开放频率,引起细胞外的Ca~(2+)经L-型钙离子通道进入心肌细胞。心肌细胞内的Ca~(2+)浓度增加,引起更多的Ca~(2+)经雷尼丁受体从SR上的钙库释放出来,也被称作钙致钙释放(calcium-induced calcium release)。L-型钙离子通道抑制剂硝苯地平可抑制82.3±3.2%电刺激诱导的心肌收缩,随后加入的三种苦味化合物均可抑制余存的心肌收缩。三种苦味化合物可能降低Ca~(2+)从雷尼丁受体的释放而降低心肌收缩力。关于苦味化合物是否通过激活TAS2Rs降低心肌收缩力,实验结果显示,苦味化合物奎宁的竞争性抑制剂GABA可以延缓奎宁对心肌收缩的抑制作用(P0.05)。基于以上功能性实验,我们推测TAS2Rs通过降低心肌细胞内Ca~(2+)的释放,从而降低心肌收缩。利用Fluo 4-AM荧光探针测定苯甲地那铵、奎宁和氯喹对大鼠心室肌细胞内钙火花释放活动的影响。结果表明苦味化合物明显降低钙火花释放的频率(P0.05)。结论:本研究首次证明了TAS2Rs mRNA在大鼠左心室表达,并揭示TAS2Rs的激活可以减慢心率和心脏的传导功能;减弱EFS和肾上腺素诱导的心肌收缩。其机制可能为苦味化合物激活TAS2Rs,降低Ca~(2+)经雷尼丁受体的释放频率,从而减弱心肌收缩。这项研究表明,TAS2Rs激动剂可能是治疗室性心动过速和心衰的有效药物。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965
【图文】：

心肌组织,心肌细胞,动物数量,左心室

RNA 在大鼠左心室心肌组织和心肌细胞表达（TAS2Rs 的 mRNAPDH；N = 6， N：动物数量；采用 multi grouped t-test，*P <心肌组织 vs. 心肌细胞）。AS2Rs mRNA are expressed in rat left ventricle tissue and news (Data were presented as relative expression of TAS2R genes to thethe number of rats, asterisks indicate multi grouped t-test：*P ＜ 0.tissue vs. cardiomyocytes).的研究结果显示，在新生大鼠的全心共表达 32 种 TAS、TAS2R126、TAS2R135、TAS2R120、TAS2R121 是表过细胞实验发现了潜在 TAS2Rs 信号转导通路的重2、瞬时受体电位阳离子通道 5（TRPM5）的表达[63]。基心室心肌组织和新分离的心肌细胞中 6 种 TAS2Rs 亚型 TAS2R120、TAS2R121、TAS2R126、TAS2R135、TA

原始记录,苯甲,奎宁

图 4.1 LVDP 原始记录。（A）分析每次给药前 5 min的记录，LVDP 的变化以给药后数据同对照（100%）的比值表示；（B）放大的 LVDP 原始记录。Figure 4.1 Original recording of langendorff experiment. (A) The 5 min recordings prior to theaddi-tion of compounds at each concentration were analysed. The LVDP was normalized to thevalues under control conditions (taken as 100%). (B) The original recording in (A) shown in anenlarged time scale.4.4 实验结果将苦味化合物苯甲地那铵、奎宁和氯喹分别加入灌流液中进行离体心脏的灌流。实验结果表明三种苦味化合物均可显著减慢大鼠离体心脏的心率 (P ＜ 0.05)，且呈浓度依赖性。苯甲地那铵和奎宁可显著增加大鼠离体心电图 QRS 波群的传导时间（P ＜ 0.05），表明苯甲地那铵和奎宁可延长心脏传导时程。其中，三种苦味化合物均可显著增加左心室收缩期（systolic duration）和舒张期（diastolicduration）（P ＜ 0.05）。苯甲地那铵和氯喹均可降低左室内压最大上升速率

苦味,动物数量,心率,差异性

图 4.2 苦味化合物降低大鼠离体心脏的心率（N = 6；N：动物数量；采用 multi grouped t-test，*P < 0.05 表示差异性显著）。Figure 4.2 Summary data showing that the decrease of heart rate in the presence of bittercompound (N = 6, the number of rats, asterisks indicate multi grouped t-test：*P ＜ 0.05 vs. controlgroup).图 4.3 苯甲地那铵和奎宁延长大鼠离体心脏 QRS 间期（N = 6；采用 multi grouped t-test，*P

【参考文献】