抗生物被膜多肽的设计及活性机理研究

发布时间：2020-08-09 02:32

【摘要】：目前,医学临床上有超过65-80%的疾病都是由生物被膜感染引起,主要包括:慢性疾病、植入医学器械的导管感染等,这些都是临床上很难彻底治疗的疾病。细菌聚集发展成群体,随后形成的生物被膜,能够使细菌的抗药性增加10-1000倍不等,使得临床治疗更加棘手。虽然已经有抗生素协同联合抗生物被膜的治疗方法,但是抗生素协同的机制不明确使得协同效果不稳定。因此,具有高效广谱抗菌的抗菌肽是目前公认的最具有抗生物被膜潜力的新型药物。本课题中,通过对有广谱高效抗菌活性的抗菌肽ZXR-2序列的优化,主要包括疏水力矩提升、带电量变化、序列长短等方面的优化,最终通过多肽二级结构的确定和生物活性的测定,得到有抗成熟生物被膜活性的多肽ZXR-2.3(FKILRFIKKLWRSLLA)。通过结晶紫染色法测定残留生物被膜和生物被膜中细菌致死实验判断ZXR-2.3的降解生物被膜能力及杀死生物被膜中细菌的能力,实验发现:ZXR-2.3在MIC浓度时杀菌和分解生物被膜的活性很明显,但是对生物被膜中细菌的致死能力强于其分解生物被膜的能力。同时,将作用机制不同的IDR-1018(VRLIVAVRIWRR-NH2)和KT2(NGVQPKYKWWKWWKKWW-NH2)分别与ZXR-2.3协同降解生物被膜,其中加入环丙沙星抗生素进行协同实验的比较,因为有文章指出IDR-1018与环丙沙星抗生素的协同效果最好。其中,IDR-1018能够通过刺激诱导第二信号分子(p)ppGpp降解,导致生物被膜的完整性被破坏,从而使成熟生物被膜被降解。而KT2可以穿过细胞膜与胞内的DNA或其他小分子结合,以杀死细菌的方式降解成熟生物被膜。随后,通过结晶紫染色实验、成熟生物被膜MTT实验、生物被膜厚度变化,甚至动态培养成熟生物被膜实验发现:能在低浓度诱导生物被膜降解的IDR-1018与ZXR-2.3的协同性最好,可以同时降解分离生物被膜和杀死生物被膜细菌。研究分析发现:两种多肽降解生物被膜的作用机制能弥补协同多肽的不足,IDR-1018主要承担解离生物被膜的作用,而ZXR-2.3通过裂解破坏细胞膜杀死细菌,所以两者的协同性最好。多肽之间协同降解生物被膜是一种新的组合方式,将通过不同作用机制来降解生物被膜的多肽协同降解生物被膜,能更快速的找到降解生物被膜的有效方法。最终,通过化学连接、linker连接等多种方法将ZXR-2.3和IDR-1018两条多肽连接成一条多肽,可同时具有降解成熟生物被膜和杀死生物被膜细菌的能力。通过本课题的实验研究,不仅通过多肽序列设计获得了有降解成熟生物被膜能力的ZXR-2.3序列,而且继续通过多肽协同降解生物被膜实验发现:将降解成熟生物被膜作用机制不同且互补的两种多肽协同反应,是一种新的快速高效降解生物被膜的方法,为针对生物被膜引起的疾病进行临床治疗具有很大潜力。
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914
【图文】：

胶凝糖，支链淀粉和黄原胶，来构造不同生物菌种的生物被膜［８］。ＥＰＳ中大逡逑量的阳离子和阴离子分子，如：糖醛酸、胞外蛋白、糖蛋白、糖脂、ｅＤＮＡ等，能够逡逑吸附外界带电物质，给生物被膜中微生物提供庇护生物被膜结构组成如图１－１所逡逑示，图中黄色方块代表的是包裹的细菌，①类似蘑菇形状的显示绿色的部分是生物被逡逑膜基质，绿色的深浅代表了营养物质与含氧量的多少，颜色越浅就说明含量越少；②逡逑代表了基质中的胞外多糖；③表明胞外ＤＮＡ；④说明了细菌的应激反应；⑤从遗传基逡逑因产物表达等多种机制决定了生物被膜易感性的特征；⑥代表了药物的外排泵；⑦说逡逑明了生物被膜内细菌之间的交流；⑧代表着持续程序细胞，几乎处于休眠的状态。逡逑１逡逑ｋ．逡逑

性会被破坏，因为需要贯穿细胞膜，所以有许多作用模式的假说，比如水桶模式、孔逡逑隙模式、地毯模式和聚集模式＿。例如，Ｍａｇａｉｎｉｎ邋１１［３１］，Ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ［３２】和Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ逡逑Ｂ［＠的作用机制分别为水桶模式，孔隙模式和地毯模式（分别为图１－３的Ａ、Ｂ、Ｃ）。逡逑许多的抗菌肽被发现是通过胞质细胞膜转移进入细胞内以其他物质作为目标［３（）］，比如逡逑Ｂｕｆｏｒｉｎ邋ＩＩ是与ＤＮＡ结合［３４］，ＰＲ－３９是抑制ＤＮＡ／ＲＮＡ／蛋白质合成［３５］。逡逑４逡逑

疏水环境中多肽二级结构，其中亲水环境懫用ＮａＡｃ溶液进行模拟，而疏水环境用ＳＤＳ逡逑溶液模拟。逡逑图３－２所示为多肽的二级结构，图Ａ为ＺＸＲ－２．１、ＺＸＲ－２．２、ＺＸＲ－２．３三条多肽在逡逑两种环境中的二级结构，图Ｂ为ＺＸＲ－２．４、ＺＸＲ－２．５、ＺＸＲ－２．６三条多肽在两种环境中逡逑的二级结构，图Ｃ为ＺＸＲ－２．７和ＺＸＲ＿２．８两条多肽在两种环境中的二级结构，图Ｄ逡逑为ＺＸＲ－２．３－１和ＺＸＲ－２．３－２两条多肽在两种环境中的二级结构。可以从中发现，当多逡逑肽在亲水环境中时，在１９８邋ｎｍ有一负峰，根据特征峰的结果分析，表明此时多肽的逡逑二级结构以无规卷曲为主。而当多肽处于疏水环境（ＳＤＳ溶液）中时，在１９８邋ｎｍ处逡逑的负峰消失，却在２０８ｎｍ处有一明显负峰，在２２２ｎｍ处有轻微的负峰，说明当多肽逡逑处于类似于细胞膜一样的疏水环境中时，两者都形成了邋ａ－螺旋结构。逡逑从实验结果表明

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本文编号：2786470