海洋真菌及海藻羊栖菜来源的抗AD等活性成分研究

发布时间：2020-08-10 16:58

【摘要】：海洋因其环境的特殊性造就了海洋生物多样性和化学多样性,是新型药物和功能食品的重要来源。在本研究中,对实验室中筛选出具有较好活性海洋真菌进行等离子体诱变和化学诱导,激活沉默基因簇,产生更多新的化合物,并用生物自显影作为示踪手段追踪,从海洋真菌和羊栖菜中发现具有抗老年痴呆相关活性(乙酰胆碱酯酶抑制、抗氧化)的小分子,这些具有特殊化学结构的活性小分子为新药提供了设计模板,为海洋药物的开发提供了先导化合物库,为防治老年痴呆等用途海洋药物与营养保健品的研究提供依据。选用减压柱层析、常压硅胶柱层析、反相柱层析、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析、制备薄层色谱、制备液相色谱以及重结晶等手段从海洋真菌Aspergillus unguis 6-20-6中分离得到新化合物1和已知化合物3、4、7、9和10。经1D、2D NMR、MS和IR等波谱学手段综合解析,鉴定化合物1为新的缩酚酸环醚Aspergillusidone G、化合物(3、4、7、9)为4个已知的缩酚酸环醚类化合物、化合物(10)为已知的环肽化合物。对上述分到的化合物及本实验室之前分到的2、5、6、8缩酚酸环醚类化合物进行了乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制活性测试、DPPH自由基清除活性测试、卤虫致死性和抗菌活性测试。结果表明化合物9对AChE的IC_(50)为56.75μM,化合物3 5显示出强的卤虫致死性,1、5和7 9显示出中等至强的抗细菌和抗真菌活性。对接研究表明,AChE和9之间的负CDOCKER相互作用能高于1,解释了9的体外抑制活性比1更好。结合海洋真菌爪曲霉Aspergillus unguis在不同因素下的HPLC指纹图谱和生物合成途径,对其代谢产物产生的机制进行了分析。当用NaBr、盐酸普鲁卡因诱导或等离子体诱变处理时,这三个因素可以促进生物合成途径中的步骤5、10、11和其他因素以产生更多的化合物1、4和7;并通过促进步骤8、9和14以促进化合物2的生成。NaBr的加入促进步骤10的溴代-氯代竞争从而促进化合物5的生成。另外,NaBr与盐酸普鲁卡因联合使用的情况下,可以促进1的生成,因此二者具有协同效应。对海洋真菌黑甲肉座菌Hypocrea lixii DLEN2008010、哈茨木霉Trichoderma harzianum DLEN2008005和青霉Penicillium sp.C21-1采用SAHA、5-azaC、Pro、BuS、CuCl_2和ZnCl_2 6种诱导剂在PSB、Malt、Soy和Rice 4种培养基下选用5个浓度梯度(10 mM、1 mM、100μM、10μM和1μM)进行化学诱导实验。结合TLC指纹图谱、HPLC指纹图谱和活性追踪,选取了DLEN2008010-Soy-Pro-10mM这个条件进行了大量发酵,从中分离得到22个化合物,对7个化合物进行了结构鉴定,化合物14为异黄酮苷类新化合物Lixiin A,新化合物的结构由1D、2D NMR和MS结合解析确定,化合物11 13、15 17均为已知的化合物,其余化合物的结构解析及所有化合物的活性测试正在进行中。对海洋真菌哈茨木霉Trichoderma harzianum DLEN2008005采用了PSB培养基进行了大量发酵,从中分离得到6个化合物和数个近纯的生物碱,鉴定出1个化合物为腺苷(18),其余化合物的结构解析及所有化合物的活性测试正在进行中。对化合物进行药物相似性分析,计算结果表明,化合物1 9、11 18基本符合预测口服药物的物理化学性质。选用TLC和生物活性自显影对比浙江洞头和湛江的海藻羊栖菜Hizikia fusifarme化学成分、活性成分,结果显示它们的成分非常相似。运用多种柱层析手段从浙江洞头羊栖菜Hizikia fusifarme中得到一个活性亚组分HFEO,运用GC-MS分析HFEO里面的主要成分,结果显示,其主要成分为十四烷酸、十六烷酸、(Z)-9-十六碳烯酸、植物醇及花生四烯酸。采用AChE抑制活性测试及DPPH自由基清除活性测试对HFEO及主要成分的单体进行了测试,结果表明,HFEO的活性主要来自于花生四烯酸。使用MTT法测试了HFEO对BV-2的细胞毒性,在20μg/mL以内对BV-2几乎没有毒性。NO测试与ROS测试表明HFEO能抑制NO的生成及降低BV-2细胞内的活性氧水平,这表明HFEO可能具有潜在的抗炎作用。考虑到该亚组分具有AChE抑制活性、抗氧化及抗神经炎症作用,其可能有作为增强记忆功能食品开发的研究价值。上述研究表明海洋真菌和海藻羊栖菜可作为抗AD等活性先导化合物的来源,本文对于开发抗AD药物或功能食品具有一定的指导意义。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914
【图文】：

次级代谢产物,真菌,组蛋白

图 1-1 不同方法调控真菌次级代谢产物的结构Fig 1-1 Structure of secondary metabolites of fungi regulated by different way.1.3 化学诱导海洋真菌次级代谢产物的研究进展1.3.1 化学诱导调控真菌次级代谢产物的机制在真核细胞中，染色质主要结构元件核小体的核心区由四种组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各 2 个分子）组成八聚体，每个组蛋白伸出核小体外的氨基端形成的组蛋白尾巴是发生组蛋白修饰的位点，表观遗传修饰一般为是对组蛋白中的氨基酸（如精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）和组氨酸（His）等）进行的乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等修饰过程[24]。DNA 甲基化转移酶抑制剂可在 DNA甲基转移酶的作用下，通过 S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供应者，将基因组内 CpG二核苷酸中胞嘧啶的 C5被甲基化形成 5-甲基胞嘧啶，降低 DNA 分子中甲基化的程度，提高基因中启动子与转录调控因子识别位点的特异性，从而激活基因的转录和表达[26]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor，HDACI）可通过与组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase，HDAC）的活性位点附

遗传修饰,次级代谢产物,表观,真菌

海洋真菌及海藻羊栖菜来源的抗 AD 等活性成分研究乏，可能会导致真菌的的某些基因低表达或不表达，利用化学诱导剂对菌株进行表观遗传修饰，以此激活或开放这些沉默的基因的表达来获得更多的先导化合物变得尤为重要[31-35]。1.3.2 表观遗传修饰剂调控真菌次级代谢产物的研究进展Williams等人[36]对Cladosporium cladosporioides进行表观遗传修饰，得到10、11 和 12 三个新化合物。从加了 5-azaC 的 Cladosporium cladosporioides 代谢物中分离得到 oxylipins 8 10，从加了 SAHA 的 Cladosporium cladosporioides 代谢物中分离得到 perylenequinones 11 17。表明了化学表观遗传修饰可以快速激活潜在的神秘真菌天然产物库。Beau 等人[37]对 Leucostoma persoonii 进行了表观遗传修饰，从中分离得到 4个化合物，其中分离得到的化合物 cytosporone R（21）为新化合物，该新化合物与 cytosporone B（18）非常相似，但是产率则极少。同时，加入了化学诱导剂后，与原始条件相比下，18 20 化合物的产率提高了。

次级代谢产物,重金属离子,真菌,倍半萜化合物

广东海洋大学硕士学位论文Paranagama 等人[38]研究了蒸馏水（A）、自来水（B）、0.5 mM CuSO4（C）、0.5 mM ZnSO4（D）、0.125 mM Cd(NO3)2（E）和 0.0125 mM K2Cr2O7（F）对Paraphaeosphaeria quadriseptata 产生 monocillin（22）的影响，22 的产率为 C >D > B > F > E >A，表明重金属对诱导真菌的代谢物起着重要作用。Wu 等人[39]对用 CuCl2对来源于海藻的 Pestalotiopsis sp. Z233 进行诱导，从中分离得到两个全新的倍半萜化合物 23 和 24，且均对酪氨酸酶显示出活性，IC50分别为 14.8 μM 和 22.3 μM。

【相似文献】