多酚化合物和抗坏血酸对蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用
发布时间：2020-08-11 07:01
【摘要】：具有正确折叠结构的蛋白质在人体生命活动中发挥着重要的生理功能,但在一定条件下,蛋白质分子可发生错误折叠,形成淀粉样沉积,从而引发多种疾病,如帕金森综合症、亨廷顿氏舞蹈症和阿尔兹海默症等。在形成淀粉样纤维的过程中,蛋白质二级结构中的α-螺旋含量减少,β-折叠含量增加,分子内部的疏水区域外露,分子间形成聚集体,进而组装成为淀粉样纤维。在此过程中,多种因素,诸如温度、pH、离子强度、环境中的大分子,以及部分小分子化合物等都可对其产生作用,影响纤维的形成。研究表明,一些天然多酚类化合物可抑制蛋白质淀粉样纤维的形成,对成熟纤维具有解聚作用,或者诱导纤维转变为无定型聚集体,从而降低纤维的细胞毒性。多酚化合物的抗纤维化作用的机制非常复杂,目前普遍认为,多酚化合物主要以其完整分子的形式与纤维作用,导致纤维的生长抑制或解聚,其易氧化的特性通常被忽视。本实验室先前实验结果表明,天然多酚的自氧化产物具有更强的抗纤维化作用。因此,进一步探索多酚化合物的自氧化性质及其产物的抗纤维化作用,对新型药物的设计及筛选具有重要意义。本研究对没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子酸和抗坏血酸在通常实验条件下的自氧化进行了分析,评估了这些化合物的稳定性,并采用牛胰岛素和溶菌酶作为淀粉样纤维化的模型蛋白,对比不同条件下形成的氧化产物对蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用,探索这些化合物及其氧化产物的抗淀粉样纤维化作用的分子机制。实验方法及研究结果1.牛胰岛素和溶菌酶的淀粉样纤维化行为在一定的实验条件下,牛胰岛素和溶菌酶可转变为淀粉样纤维。实验采用硫磺素T(ThT)荧光标记法、圆二色谱法检测淀粉样纤维化过程中蛋白质二级结构的变化,8-苯胺基-1-苯磺酸钠(ANS)检测纤维化过程中蛋白质疏水区域的暴露程度,透射电子显微镜(TEM)对纤维化过程中形成的聚集体形貌进行表征。结果表明,牛胰岛素和溶菌酶在形成淀粉样纤维的过程中,其二级结构中β-折叠的含量逐渐增多,逐渐暴露的疏水区域与荧光探针特异性结合,显示出较高的荧光强度,同时,TEM可观测到牛胰岛素和溶菌酶形成的纤维结构。2.EGCG及其氧化产物对蛋白质淀粉样纤维化的作用具有多酚结构的EGCG在通常的溶液条件下不稳定,容易发生自氧化。本研究探索了 EGCG在pH 6.5～9.0条件下的稳定性,并对其氧化产物EGCGox对牛胰岛素和溶菌酶淀粉样纤维化过程的影响进行了评估。实验结果表明,EGCG对纤维化过程有一定的抑制作用,不同pH条件下形成的EGCGox对纤维化的抑制作用都强于EGCG,其中,在弱碱性条件下形成的氧化产物对纤维生长的抑制效果更强。在此基础上,对pH 7.4条件下形成的氧化产物的抗纤维化作用进行了进一步的探究,结果表明,pH 7.4条件下形成的EGCGox具有较强的抑制纤维生长的作用,同时对成熟纤维也具有较好的降解作用。3.没食子酸对淀粉样纤维化的抑制作用对EGCG在pH 7.4条件下形成的氧化产物进行高效液相色谱和质谱分析,发现经氧化形成的EGCGox主要由相对分子量为170的小分子化合物组成,通过分析和推断,确定该分子为另一种多酚化合物—没食子酸。以溶菌酶作为模型蛋白,发现没食子酸对溶菌酶纤维的生长具有抑制作用,同时能够降解成熟的溶菌酶纤维。与EGCG一样,没食子酸的分子结构也不稳定,在pH 7.4条件下会再次发生氧化。经过对比发现,没食子酸氧化产物的抗纤维化作用仍强于没食子酸。4.抗坏血酸对蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用抗坏血酸(Ascorbic acid),又称为维生素C(VetaminC;Vc),是一种重要的维生素和生物抗氧化剂。研究表明,Vc具有抑制蛋白质纤维化的作用,并且蛋白质淀粉样沉积相关疾病通常伴随着Vc的代谢异常。Vc在生理条件下的自氧化及其不稳定性与其生物活性密切相关。所以,分析Vc的自氧化行为,探索Vc自氧化产物的抗淀粉样纤维化作用具有重要意义。本研究以溶菌酶和牛胰岛素为模型蛋白,探索了 Vc的自氧化动力学,检测了 Vc及其主要自氧化产物脱氢抗坏血酸和赤藓酮糖的抗淀粉样纤维化作用。结果表明,Vc在酸性和弱碱性条件下都不稳定,易发生自氧化。Vc及其自氧化产物均可抑制溶菌酶淀粉样纤维化和降解成熟的淀粉样纤维,其抗纤维化作用与Vc的氧化程度呈正相关,即Vc的氧化程度越高,产物的抗纤维化作用越强。因此,Vc的自氧化产物可能是其抗纤维化作用的主要活性形式。结论:多酚类化合物EGCG、没食子酸,以及抗氧化剂Vc对蛋白淀粉样纤维化具有一定的抑制作用,本文对这些化合物在不同pH条件下的稳定性及其氧化产物的抗纤维化作用进行了研究。结果表明,EGCG在弱碱性条件下易发生氧化,所有pH条件下形成的EGCGox都具有比EGCG更强的抗纤维化作用,在pH 7.4条件下形成的EGCGox对蛋白纤维化具有更好的抑制效果。没食子酸作为EGCG的一种主要氧化产物,同样对淀粉样纤维化具有抑制作用,但其化学结构仍不稳定,产生的氧化产物对纤维化的抑制作用仍强于没食子酸。维生素C在通常实验条件下易发生自氧化,生成多种氧化产物,通过对比实验发现,Vc的氧化产物脱氢抗坏血酸和赤藓酮糖具有比Vc更强的抗淀粉样纤维化作用。上述结果揭示了几种常见的天然还原剂的抗淀粉样纤维化作用与其自氧化性质有关,进一步对这些氧化产物进行分离和筛选,可以寻找出具有更强作用的蛋白淀粉样纤维化抑制剂,为研发神经退行性疾病的治疗药物提供了新的选择。
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：
白进行了氨基酸测序，发现不同物种胰岛素的一级结构基本相似。人胰岛素与牛逡逑胰岛素的不同点仅表现为Ａ链中第８位的丙氨酸被苏氨酸代替，第１０位的缬氨酸逡逑被异亮氨酸代替，而Ｂ链中的第３０位丙氨酸被苏氨酸代替（图１－２）。胰岛素分逡逑子中除了通过三个二硫键连接两条肽链形成分子结构外，同时还通过复杂的氢键逡逑作用使蛋白分子维持相对稳定的空间结构［３２＿３４］。逡逑午膜Ｓ象逡逑人胰岛素■逦撕逡逑牛胰岛康逡逑图１－２牛胰岛素与人胰岛素的一级结构逡逑Ｆｉｇ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｓｔｉ＊ｕｃｔｕｒｅ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｂｏｖｉｎｅ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ａｎｄ邋ｈｕｍａｎ邋ｉｎｓｕｌｉｎ．逡逑由于生物体中的胰岛素结构基本相似，分子结构相对比较简单，并且具有特逡逑定的空间结构。在特定条件下，牛胰岛素能够在体外条件下形成淀粉样蛋白，因逡逑此非常有利于蛋白质折叠结构的探宄。结果表明，牛胰岛素在ＰＨ２，邋６５邋°Ｃ的条件逡逑下能够形成淀粉样纤维。逡逑１．４溶菌酶逡逑４逡逑
三级结构是则在二级结构的基础上通过盘绕形成紧密的椭球型结构，其三级结构逡逑中含有三个ａ－螺旋结构，同时还有部分肽链经过反折叠形成反平行式的Ｐ－折叠结构逡逑［３９］（图１－３）。而据文献报道，溶菌酶表面形成的裂隙，贝！Ｊ是溶菌酶的活性中心，逡逑酶的催化活性则是由蛋白质的三级结构决定的［４０］。逡逑＆ｉｒｒｖ；）逡逑Ｉ邋￥}擦願犲义贤迹保橙芫傅慕峁雇迹ǎ粒督峁梗唬ǎ拢┤督峁瑰义希疲椋珏澹保常澹裕瑁邋澹穑颍椋恚幔颍澹幔睿溴澹常腻澹螅簦颍酰悖簦酰颍邋澹铮驽澹瑁澹铄澹澹纾珏澹鳎瑁椋簦邋澹欤螅铮恚澹义先芫冈谔囟ǖ奶跫拢梢栽谔逋庑纬傻矸垩鞍住Ｔ诒疚闹校颐峭ü义隙约Φ扒迦芫冈谒嵝蕴跫碌娜却砝唇械矸垩酆稀＝峁砻鳎呶潞偷湾义希穑忍跫蓟岬贾码牧炊狭押碗亩蔚男纬桑冢校龋玻澹叮靛
本文编号：2788748
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96
【图文】：
白进行了氨基酸测序，发现不同物种胰岛素的一级结构基本相似。人胰岛素与牛逡逑胰岛素的不同点仅表现为Ａ链中第８位的丙氨酸被苏氨酸代替，第１０位的缬氨酸逡逑被异亮氨酸代替，而Ｂ链中的第３０位丙氨酸被苏氨酸代替（图１－２）。胰岛素分逡逑子中除了通过三个二硫键连接两条肽链形成分子结构外，同时还通过复杂的氢键逡逑作用使蛋白分子维持相对稳定的空间结构［３２＿３４］。逡逑午膜Ｓ象逡逑人胰岛素■逦撕逡逑牛胰岛康逡逑图１－２牛胰岛素与人胰岛素的一级结构逡逑Ｆｉｇ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｓｔｉ＊ｕｃｔｕｒｅ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｂｏｖｉｎｅ邋ｉｎｓｕｌｉｎ邋ａｎｄ邋ｈｕｍａｎ邋ｉｎｓｕｌｉｎ．逡逑由于生物体中的胰岛素结构基本相似，分子结构相对比较简单，并且具有特逡逑定的空间结构。在特定条件下，牛胰岛素能够在体外条件下形成淀粉样蛋白，因逡逑此非常有利于蛋白质折叠结构的探宄。结果表明，牛胰岛素在ＰＨ２，邋６５邋°Ｃ的条件逡逑下能够形成淀粉样纤维。逡逑１．４溶菌酶逡逑４逡逑
三级结构是则在二级结构的基础上通过盘绕形成紧密的椭球型结构，其三级结构逡逑中含有三个ａ－螺旋结构，同时还有部分肽链经过反折叠形成反平行式的Ｐ－折叠结构逡逑［３９］（图１－３）。而据文献报道，溶菌酶表面形成的裂隙，贝！Ｊ是溶菌酶的活性中心，逡逑酶的催化活性则是由蛋白质的三级结构决定的［４０］。逡逑＆ｉｒｒｖ；）逡逑Ｉ邋￥}擦願犲义贤迹保橙芫傅慕峁雇迹ǎ粒督峁梗唬ǎ拢┤督峁瑰义希疲椋珏澹保常澹裕瑁邋澹穑颍椋恚幔颍澹幔睿溴澹常腻澹螅簦颍酰悖簦酰颍邋澹铮驽澹瑁澹铄澹澹纾珏澹鳎瑁椋簦邋澹欤螅铮恚澹义先芫冈谔囟ǖ奶跫拢梢栽谔逋庑纬傻矸垩鞍住Ｔ诒疚闹校颐峭ü义隙约Φ扒迦芫冈谒嵝蕴跫碌娜却砝唇械矸垩酆稀＝峁砻鳎呶潞偷湾义希穑忍跫蓟岬贾码牧炊狭押碗亩蔚男纬桑冢校龋玻澹叮靛
本文编号：2788748
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