微囊藻毒素-LR对α4过表达的人肝细胞系HL7702的影响

发布时间：2020-08-11 07:02

【摘要】：研究背景:随着经济的高速发展,由人类经济活动产生的水体富营养化及其所造成的水华暴发成为全球关注的重要环境问题。水华暴发时,大量繁殖的藻类所产生的次生代谢物微囊藻毒素(microcystins,MCs)对水生生物和人类具有健康威胁。在超过100种的MCs异构体中,微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是最为常见且毒性最强的一种,肝脏是其主要的靶器官。MC-LR可以引发一系列的肝毒性,包括诱导肝细胞坏死、凋亡、肝出血等。目前认为,MC-LR的主要致毒机理是通过抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2 A,PP2 A)的活性从而产生一系列的细胞毒性作用。PP2A是细胞内主要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,参与了包括细胞骨架动态调控在内的多种细胞生命活动。α4是PP2A 一个重要的调节蛋白,它能对PP2A进行多种调节,包括调节PP2A活性和促进PP2A核心酶组装。α4的过表达能够促进细胞增殖和细胞存活。α4还对细胞骨架具有一定调节作用。本实验室前期发现MC-LR能够在多种细胞系中诱导细胞骨架发生重构,这可能与其抑制PP2A活性有关。随后,我们在人胚肾293细胞(HEK293)内观察到低浓度MC-LR引发了 PP2A活性应激性上调,这一现象可能与α4和PP2A/C亚基结合的改变有关,暗示α4参与了对MC-LR细胞毒性效应的调节过程。将HEK293细胞内α4蛋白过表达后,本实验室最近还观察到MC-LR对细胞骨架的破坏作用消失了,提示在MC-LR毒性效应下α4的过表达提高了 HEK293内细胞骨架的稳定性,这引发了我们如果在其它细胞系中过表达α4是否具有同样效应的思考。本实验将探究MC-LR处理α4过表达的人肝细胞系7702(HL7702)后产生的各种细胞效应,这有助于更好地阐明MC-LR毒性效应下α4,PP2A和细胞骨架的关系。研究方法:利用lipofectamineTM2000将α4表达质粒载体转入HL7702内24h后,再分别用不同浓度的MC-LR(0μM,1μM和10μM)处理24h。空载质粒作为空载对照组。应用酶活性测定试剂盒、免疫印迹技术、免疫荧光技术和免疫共沉淀技术对本实验条件下产生的各种细胞效应和相关分子变化进行检测。研究结果:MC-LR染毒α4过表达的HL7702后:PP2A活性受到显著抑制;PP2A亚基蛋白水平和PP2A/C亚基的翻译后修饰水平受到影响,如PP2A/C亚基表达上调,PP2A/C亚基Y307位点磷酸化水平升高,PP2A/C亚基L309位点甲基化水平降低;PP2A/C亚基和α4的结合以及PP2A/C亚基和PP2A/A亚基的结合均显著下降;PP2A 活性受到抑制的同时,p-ERK(T202/Y204),p-JNK(T183/Y185)和p-P38(T180/Y182)磷酸化水平显著上升,表明三条MAPK通路同时被激活;细胞内微丝,微管和中间纤维形态和分布没有发生变化,细胞骨架结构稳定,而骨架相关蛋白VASP(S157)和Ezrin(T567)磷酸化水平上调,VASP(S239)磷酸化水平下调。研究结论:α4过表达后,MC-LR仍然抑制了 HL7702细胞的PP2A活性,其作用方式可能是改变PP2A/C亚基蛋白水平及其翻译后修饰水平,改变PP2A/C亚基和α4的结合以及PP2A/C亚基和PP2A/A亚基的结合;与未过表达α4的HL7702细胞类似,ERK1/2,P38和JNK三条通路依然被激活;α4的过表达在一定程度上拮抗了 MC-LR对骨架的破坏作用,与骨架相关蛋白VASP(S157),VASP(S239)和Ezrin(T567)的磷酸化水平改变有关;α4过表达的HL7702细胞对MC-LR的响应与α4过表达的HEK293中类似,但机制有所不同。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99
【图文】：

亚基,翻译后修饰,过表达,甲基化水平

学硕士学位论文逦实验结果逡逑邋ＭＣ－ＬＲ处理ａ４过表达的ＨＬ７７０２细胞后ＰＰ２Ａ亚基蛋白水平及翻译后修饰的逡逑应用免疫印迹法检测ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基和ＰＰ２Ａ／Ａ亚基的表达情况。结果如图４．２．２，ｃｘ４过表达后，随着染毒浓度的增大，ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基的表达逐渐升高，在最高逡逑浓度Ｐ１０组中出现了显著升高。ＰＰ２Ａ／Ａ亚基的表达水平在各组中都没有发生逡逑改变。ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基上３０７位点酪氨酸（Ｙ３０７）的磷酸化水平以及３０９位点亮逡逑（Ｌ３０９）的甲基化水平也有一定改变，随着ＭＣ－ＬＲ染毒浓度的增大，ｐ－ＰＰ２Ａ／Ｃ３０７）的磷酸化水平上升，在最高染毒浓度Ｐ１０组中出现了显著升高，而逡逑Ｐ２Ａ／Ｃ邋（Ｌ３０９）的甲基化水平下降，在最高染毒浓度Ｐ１０组中出现了显著下降。逡逑

细胞内,亚基,过表达,结合水

浙江大学硕士学位论文逦实验结果逡逑４．２．３邋ＭＣ－ＬＲ邋处理ａ４邋过表达的邋ＨＬ７７０２邋细胞后造成邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋和ｃｔ４，邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋和邋ＰＰ２Ａ／Ａ逡逑解离逡逑采用免疫共沉淀法，本研究检测了细胞中ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基和ａ４以及ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基逡逑和ＰＰ２Ａ／Ａ亚基结合水平的变化。结果如图４．２．３所示，ａ４过表达后，随着ＭＣ－ＬＲ逡逑染毒浓度的升高，ａ４与ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基的结合降低，在最高染毒浓度Ｐ１０组中结合逡逑水平显著降低。另一方面，ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基和ＰＰ２Ａ／Ａ亚基的结合也随着ＭＣ－ＬＲ染逡逑毒浓度的升高而降低，在最高染毒浓度Ｐ］0组中结合水平显著降低。逡逑

微丝,细胞内,亚基,结合水

解离逡逑采用免疫共沉淀法，本研究检测了细胞中ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基和ａ４以及ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基逡逑和ＰＰ２Ａ／Ａ亚基结合水平的变化。结果如图４．２．３所示，ａ４过表达后，随着ＭＣ－ＬＲ逡逑染毒浓度的升高，ａ４与ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基的结合降低，在最高染毒浓度Ｐ１０组中结合逡逑水平显著降低。另一方面，ＰＰ２Ａ／Ｃ亚基和ＰＰ２Ａ／Ａ亚基的结合也随着ＭＣ－ＬＲ染逡逑毒浓度的升高而降低，在最高染毒浓度Ｐ］0组中结合水平显著降低。逡逑Ｉｎｐｕｔ逦ＩｇＧ逦Ｖｅｃ逦Ｐ０逦ＰＩ逦Ｐ１０逡逑ａ４逦ｍｕＭｉｎｉ灥逡逑ＰＰ？Ａ／ｒ逦４Ｍｍｉｍ逦ｆｌＨＢＩ逡逑Ｊｒ邋－ｉ邋ｚ＾ｊｔ＼Ｊ邋ｖ＿逦逦邋逦－逦．邋１逦＇＊＇＇＇？逡逑ｐｐ遍逦————逡逑ｐｐ＊＾ａ／ｃ逡逑图４．２．３邋ＭＣ－ＬＲ对ａ４过表徸的ＨＬ７７０２细胞内ＰＰ２Ａ／Ｃ和ｃｔ４，邋ＰＰ２Ａ／Ｃ和ＰＰ２Ａ／Ａ结合的逡逑影响。＊，ｐ＜0．0５；邋＊＊，ｐ＜０．０１；邋＊＊＊，邋ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３逡逑Ｆｉｇ．邋４．２．３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＭＣ－ＬＲ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｏｆ邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋ａｎｄ邋ａ４邋ａｓ邋ｗｅｌｌ邋ａｓ邋ＰＰ２Ａ／Ｃ邋ａｎｄ逡逑ＰＰ２Ａ／Ａ邋ｉｎ邋ａ４－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ邋ＨＬ７７０２邋ｃｅｌｌｓ．邋＊，邋ｐ＜０．０５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１；邋＊＊＊，邋ｐ＜０．００１；邋ｎ＝３逡逑２０逡逑

【参考文献】