智能响应性纳米介孔硅药物递送系统构建与抗肿瘤应用

发布时间：2020-08-15 12:23

【摘要】：恶性肿瘤是致死率最高的疾病之一。目前,恶性肿瘤的临床治疗仍面临巨大挑战。纳米科技的发展为肿瘤抑制提供了新的契机。基于纳米颗粒的抗肿瘤药物递送系统具有明显优势,包括提高药物的稳定性和生物利用度,降低药物对正常组织的副作用。更重要的是,凭借其独特的增强渗透性和滞留性(EPR)效应,纳米颗粒被广泛开发为药物递送载体。随着对肿瘤微环境的不断了解,基于肿瘤微环境的内源性特征(pH,谷胱甘肽,三磷酸腺苷,酶等)或外源性刺激信号(光,磁场,超声等)构建的智能响应药物递送系统相继被开发。这些智能药物递送系统能在宿主体内循环中表现出零过早释放‖,而在信号刺激下将药物递送到肿瘤部位,并原位释放药物,显著降低药物的系统毒性。在众多纳米材料中,介孔硅纳米颗粒(MSNs)由于其良好的生物相容性、较高的药物负载效率、尺寸可调性以及表面易修饰性等优势引起人们广泛关注。然而,基于纳米颗粒的药物递送系统仍然面临递送效率低的问题。主要原因在于在静脉给药情况下,纳米制剂在体内运输过程中会遭遇一系列生理和病理障碍,包含血液、肿瘤组织和肿瘤细胞三个层面的屏障,如肾清除、非特异性的蛋白吸附和单核吞噬系统的清除、致密的肿瘤基质和较高的瘤内压力、细胞膜屏障、溶酶体捕获以及肿瘤耐药性等,极大地阻碍了纳米药物的有效递送。因此,迫切需要开发具有克服递送障碍的新型纳米体系以切实提高肿瘤抑制效果。基于以上背景,本论文以克服纳米药物递送障碍和提高肿瘤抑制效果为目的,选用介孔硅颗粒作为基础材料,设计并制备了几种智能响应性的纳米药物递送系统,并评价其抗肿瘤相关生物学性能。主要的研究内容和结论如下:(1)级联pH响应性的中空硅药物控释系统的构建及抗肿瘤研究为了克服药物递送过程中血液层面障碍和细胞膜屏障,以中空介孔硅为载体,通过两种酸敏感的化学键(硼酸酯和苯亚胺键)依次将β-环糊精和PEG引入到颗粒表面,其中β-环糊精作为介孔封堵剂防止药物泄漏,PEG赋予纳米颗粒隐身特性。一系列表征证实我们已成功构建了级联pH响应性的纳米药物递送系统(HMSNs-β-CD/Ada-PEG)。药物释放实验证明了该体系具有pH控释特性。蛋白吸附和巨噬细胞吞噬实验结果显示HMSNs-β-CD/Ada-PEG体系能显著抑制非特异性蛋白吸附和细胞摄取,证实了其潜在的血液稳定性。随后我们在体外细胞层面检测纳米体系的细胞摄取以及细胞凋亡情况。实验证明HMSNs-β-CD/Ada-PEG体系在弱酸条件下吞噬效率较高,证实了第一重pH响应可介导PEG脱离并促进肿瘤细胞内吞。激光共聚焦、DNA ladder以及流式分析等凋亡检测实验证实胞内溶酶体酸性条件可介导第二重pH响应,导致β-环糊精的脱离和药物的胞内释放,进而诱导细胞凋亡。最后,体内实验结果表明HMSNs-β-CD/Ada-PEG@DOX具有良好的生物安全性且能显著抑制体内肿瘤的生长。本研究为基于肿瘤微环境刺激响应的新型药物递送系统的开发提供新思路。(2)多级刺激响应性中空硅纳米体系用于肿瘤深层渗透和程序化抗肿瘤研究为了克服药物递送的组织渗透障碍以提高整体疗效,我们制备了多级刺激响应性电荷/尺寸双转换的多功能纳米系统。以中空介孔硅(HMSN)为药物载体,依次引入亲水性的壳寡糖(CS)、二甲基马来酸酐(DMA),其中电负性的DMA赋予中空硅颗粒(HMSN-CS(DMA))电荷反转特性。在装载抗癌药吉西他滨(GEM)后,将预先制备小粒径的顺铂前药偶联的树枝状分子(PAMAM-Pt)通过静电作用整合到颗粒表面来制备纳米体系(HMSN@GEM-CS(DMA)/PAMAM-Pt)。所制备的纳米系统在pH 7.4条件下有稳定的结构和合适的尺寸,有利于肿瘤富集。一旦到达肿瘤组织,该体系可响应肿瘤微环境弱酸性,解体成HMSN@GEM-CS(～120 nm)和PAMAM-Pt树枝状大分子(～5 nm)。然后HMSN@GEM在表面肿瘤组织发挥抗肿瘤作用,而PAMAM-Pt凭借其小尺寸渗透到肿瘤深层,实现正电荷介导的胞吞作用和溶酶体逃逸。最后PAMAM-Pt在胞内还原环境下释放出活性顺铂,杀死位于组织深层的肿瘤细胞。一系列表征实验证实我们已成功构建了HMSN@GEM-CS(DMA)/PAMAM-Pt复合体系。Zeta电位和水动力学直径检测证明HMSN-CS(DMA)/PAMAM-Pt体系具有pH依赖性的电荷/尺寸双重转换特性。释放实验表明HMSN-CS(DMA)/PAMAM-Pt体系可响应弱酸和还原刺激依次释放PAMAM和顺铂。多细胞球模型体外实验证明HMSN-CS(DMA)/PAMAM-Pt体系可在弱酸条件下获得有效的细胞球渗透和肿瘤细胞摄取,有效地诱导细胞凋亡。最后,体内实验结果表明HMSN@GEM-CS(DMA)/PAMAM-Pt具有良好的生物安全性且能显著抑制体内肿瘤的生长。(3)近红外光响应性的介孔硅药物控释系统的构建与生物学评价为了克服溶酶体屏障以及增加纳米药物体系的临床可用性,我们构建了一种光响应性的MSN-ZOL@t LB-IR780药物控释系统。以介孔硅颗粒作为基底材料,通过超支化聚乙烯亚胺(PEI)缓冲层将脂质双层稳定的偶联到颗粒表面,其中抗癌药物ZOL和光敏剂IR780分别被装载到介孔硅和脂质双层内。相关表征手段证明我们已成功制备了MSN-PEI@t LB体系。释放实验表明MSN-calcein@tLB-IR780体系具有近红外光响应性的药物控释特征。随后,细胞层面的激光共聚焦和流式分析等检测结果证明MSN-calcein@tLB-IR780体系可被肿瘤细胞高效内吞,并在近红外照射情况下在胞内产生活性氧,进而通过光化学内化作用介导药物释放以及溶酶体的逃逸。细胞活性检测、细胞核形态观察以及凋亡双染实验结果证明与单一疗法相比,MSN-ZOL@t LB-IR780体系介导的化疗和光动力联合疗法在抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡方面具有更加显著的效果,该生物相容性良好的多功能纳米体系具有潜在的临床应用前景。(4)肿瘤弱酸性活化的多功能硅包金纳米系统的构建及抗肿瘤研究为了克服药物递送的血液障碍,细胞膜屏障以及规避耐药性,我们制备了兼具电荷反转、线粒体靶向以及多重增强的光动力和光热联合疗法的多功能纳米系统。在介孔硅涂层金纳米棒(AuNR@MSN)装载光敏剂ICG后,引入β-环糊精、功能肽RLA、PEG聚合物,制备复合纳米系统(AuNR@MSN-ICG-RLA/CS(DMA)-PEG)。一系列表征实验证实我们已成功制备了AuNR@MSN-ICG-RLA/CS(DMA)-PEG复合纳米。活性氧检测证实了所构建的复合体系具备多重活性氧产生机制。细胞实验证明AuNR@MSN-ICG-RLA/CS(DMA)-PEG体系具有pH依赖性的肿瘤细胞内吞、线粒体靶向以及在近红外光照下诱导肿瘤细胞凋亡的特性。体内实验证明AuNR@MSN-ICG-RLA/CS(DMA)-PEG体系可以凭借其表面的CS(DMA)-PEG聚合物实现肿瘤的靶向富集,进而在近红外照射下显著抑制体内肿瘤生长且不损伤正常的组织。该体系为基于光疗的新型多功能纳米系统的开发提供新思路。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96;R943
【图文】：

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重庆大学博士学位论文游离药物相比，纳米药物载体具有许多明显的优势，例如增加药物稳药物在肿瘤组织中积累以及控制药物的释放等[10, 11]。这些优点可以显的生物利用度，降低其系统毒性。其中，实体瘤中增强的渗透性和滞R）的发现是纳米药物载体快速发展的最大动力[12]。具体来说，如图 1.1组织的血管内皮结构是致密且有序的，大分子和纳米颗粒难以从血管中瘤组织需要大量的氧气和营养物质以维持其快速生长，因此具有快速肿瘤血管通常具有高度无序，间隙宽，结构完整性差等缺陷，这就提或纳米颗粒从血管渗入到肿瘤组织的机会；与此同时，受损的淋巴引步增强了大分子或纳米颗粒在肿瘤组织中的滞留[13, 14]。增加的渗透和作用促进了纳米颗粒在肿瘤中的积累。

示意图,纳米颗粒,药物,肿瘤组织

血管通常具有高度无序，间隙宽，结构完整性差等缺陷，这就米颗粒从血管渗入到肿瘤组织的机会；与此同时，受损的淋巴强了大分子或纳米颗粒在肿瘤组织中的滞留[13, 14]。增加的渗透促进了纳米颗粒在肿瘤中的积累。图 1.1 典型的 EPR 效应示意图[13]1.1 Schematic representation of the enhanced permeability and retention (EPR)

示意图,金纳米颗粒,肿瘤抑制,示意图

括各种无机纳米颗粒如介孔二氧化硅纳米颗粒[16-18]，金纳米颗粒[1粒[20, 21]等和各种有机纳米材料如聚合物纳米颗粒[22]，脂质体[23, 24]和了获得靶向功能，纳米载体设计还可结合特异性靶向组分（即肽[2，乳糖[28, 29]，叶酸[30]，透明质酸[31]等）以增加载体对靶细胞的识别表性的无机纳米载体中，金和氧化铁纳米颗粒以其特有的物化性质。与其他金属纳米颗粒相比，金纳米颗粒具有较高的化学稳定性，改变制备参数来调节金颗粒的形状，如球形，棒状，笼状等。此外颗粒的光吸收和光散射性质还可用于光热和光动力治疗。目前已有纳米颗粒作为载体递送抗肿瘤药物如多柔比星，喜树碱，5-氟尿嘧啶用于肿瘤化疗[32]。2011 年，Wang 等构建了基于金纳米颗粒的药物控伤癌细胞[33]。如图 1.3 所示，该系统以金纳米颗粒为载体，将抗癌药酸敏感性的腙键偶联到颗粒表面制备药物控释体系。当该体系经癌胞内酸性溶酶体后，腙键连接纽带水解，实现 pH 响应性的阿霉素颗粒凭借其独特的光学性能在药物释放的同时可实现阿霉素荧光的可视化的肿瘤抑制。

【参考文献】