抗结肠癌细胞活性的瑞士乳杆菌及真菌发酵产物筛选及其作用机制初步研究

发布时间：2020-08-15 13:25

【摘要】：为了筛选具有抗肿瘤活性的微生物发酵产物,本课题选择了瑞士乳杆菌和四种食药用真菌的发酵产物,以结肠癌细胞SW480为体外研究模型,来研究发酵产物的抗肿瘤活性,并对其作用机制进行初步研究。本论文的第一部分主要研究了瑞士乳杆菌胞外多糖对结肠癌细胞SW480增殖、凋亡、转移的影响。当胞外多糖处理时间为12h、24h时,随着浓度的增加,结肠癌细胞SW480的存活率无明显变化,当胞外多糖处理48h,1mg/mL的处理浓度下,结肠癌细胞SW480存活率发生显著降低,为对照组的80.5%。并且随着胞外多糖处理浓度的增加,结肠癌细胞SW480存活率降低越来越明显,处理48h后,10mg/mL的处理浓度下存活率降低为对照组的33.5%。这表明瑞士乳杆菌胞外多糖能抑制结肠癌细胞SW480增殖,并呈时间和浓度依赖关系。为了进一步研究了瑞士乳杆菌胞外多糖对结肠癌细胞SW480增殖的抑制作用是否的通过诱导细胞凋亡引起的,我们检测了经5mg/mL和10mg/mL胞外多糖处理48h后SW480细胞凋亡率的变化,结果表明经5mg/mL、10mg/mL的胞外多糖处理后,SW480细胞发生凋亡的比例与未经处理的对照组相比没有显著变化,表明胞外多糖抑制SW480细胞增殖不是通过诱导凋亡实现。接着我们又研究了胞外多糖处理对SW480细胞迁移的影响。结果显示与对照组相比用2.5mg/mL和5mg/mL胞外多糖处理的SW480细胞迁移能力显著降低。以上研究表明胞外多糖能够抑制SW480细胞增殖、迁移,但未能引起SW480细胞凋亡。本论文第二部分主要研究了灵芝真菌、平菇真菌、乳白耙菌、裂褶菌四种真菌用土豆培养基,以及在土豆培养基的基础上分别添加了2%枳实、2%玉米秸秆、2%红薯渣基质培养基培养的发酵产物,对结肠癌细胞SW480增殖及细胞凋亡的影响。首先通过CCK8实验初步研究了四种真菌的不同发酵产物对结肠癌细胞SW480增殖的影响,发现四种真菌中裂褶菌发酵产物的抗肿瘤活性最强;而在土豆培养基中添加的三种不同基质中,添加玉米秸秆基质能有效增强不同真菌发酵产物的抗肿瘤活性。因此,我们挑选添加玉米秸秆基质的裂褶菌发酵产物进一步研究其降低结肠癌细胞SW480存活率的机制。经流式细胞仪检测发现经该发酵产物处理的SW480细胞中凋亡细胞的含量显著增加,并且蛋白免疫印记结果显示经该发酵产物处理的SW480细胞中Caspase3、PARP蛋白被切割,进一步证实了该发酵产物能够诱导结肠癌细胞SW480凋亡。接下来为确定该发酵产物诱导SW480细胞凋亡的具体途径,我们检测了该发酵产物对SW480细胞线粒体膜电位的影响,结果发现经该发酵产物处理后SW480细胞线粒体膜电位明显降低,同时活性氧水平显著提高,表明该发酵产物可能通过激活线粒体介导的凋亡通路诱导结肠癌细胞SW480凋亡。综上所述,本研究发现了瑞士乳杆菌胞外多糖能降低结肠癌细胞SW480存活率并抑制其迁移但未能诱导细胞凋亡;四种真菌发酵产物中,裂褶菌发酵产物的抗肿瘤活性最强;而三种不同基质中,添加玉米秸秆基质能有效增强不同真菌发酵产物的抗肿瘤活性。且研究发现添加玉米秸秆基质的裂褶菌发酵产物能够降低SW480细胞线粒体膜电位,并且提高SW480细胞活性氧的水平,表明其可通过激活线粒体凋亡途径诱导结肠癌细胞SW480凋亡。本研究初步筛选出来具有抗结肠癌细胞SW480活性的发酵产物,为后续进一步研究该发酵产物并从中分离出良好的抗肿瘤活性物质奠定基础。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965.1
【图文】：

CCK8 法测定瑞士乳杆菌胞外多糖处理 12、24、48h 对结肠癌细胞 SW480 存活率度的胞外多糖处理结肠癌细胞 SW480 12h、24h、48h 后细胞的存活率。读取加入 CC值。各时刻 0mg/mL 处理组的吸光值标准化为 100%。数据表示为 mean±SD，n=差异 *：P<0.05 ， **：P<0.01 ，***：P<0.001 ，****：P<0.0001。瑞士乳杆菌胞外多糖对结肠癌细胞 SW480 凋亡的影响越来越多的研究表明，许多植物多糖、真菌多糖等多糖类物质是通过诱导亡来发挥它抑制肿瘤功能的。那么瑞士乳杆菌胞外多糖是否也是通过诱导来抑制细胞存活率，进而发挥其抗肿瘤功效呢？为检测瑞士乳杆菌胞外多糖能否诱导结肠癌细胞凋亡，在本文中采用荧光xin V-FITC 和荧光染料 PI 双染细胞的方式，通过流式细胞仪检测细胞是亡。结果如图 3.2 所示，其中左上象限表示坏死细胞所在的区域，右上象限凋亡细胞所在的区域，左下象限表示活细胞所在的区域，右下象限表示的

SW480 中发生凋亡的细胞比例没有发生显著改变，胞 SW480 凋亡无影响。胞外多糖降低结肠癌细胞胞凋亡介导，有可能通过影响细胞周期来起作用，等来实现，具体的作用方式需要进行进一步实验研ntrol 组 5mg/mL 处理组 10mg/mL7.6%1.3%7.8%1.7%Annexin-FITC

21 不同浓度的瑞士乳杆菌胞外多糖处理结肠癌细胞 SW480 迁移能力的影响（100μ/mL 胞外多糖处理组 、2.5mg/mL 胞外多糖处理组 、5mg/mL 胞外多糖处理组 80 划痕区域面积。B：瑞士乳杆菌胞外多糖对结肠癌细胞 SW480 划痕区域面积析。以 0h 细胞的划痕面积为 100%，量化之后时间点的划痕面积。数据表示为 m

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本文编号：2794176