蝙蝠蛾拟青霉与放线菌共培养对次生代谢产物的影响

发布时间：2020-08-20 21:49

【摘要】：为了探究蝙蝠蛾拟青霉与放线菌共培养对次生代谢产物的影响。从冬虫夏草周围微生态系统中分离获得一株具有较强抑菌活性的放线菌TY134,通过16S r DNA序列分析,鉴定为极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)。以大米固体培养基作为发酵基质分别进行蝙蝠蛾拟青霉单培养、放线菌TY134单培养以及蝙蝠蛾拟青霉与放线菌TY134共培养,培养30 d之后,将发酵产物用乙酸乙酯超声辅助提取,采用高效液相色谱(HPLC)和双层平板打孔法分别分析了单培养和共培养乙酸乙酯提取物化学成分和抑菌活性的差异。实验结果表明:共培养发酵产物的乙酸乙酯提取物在保留时间Rt=14.143 min处出现了一个新增的吸收峰,而在单培养中并没有这个吸收峰的出现;而且共培养发酵产物乙酸乙酯提取物的抑菌活性明显要强于单培养,产生了新的抑菌活性物质。说明共培养可作为一种产生新的生物活性次级代谢产物的有效途径。
【图文】：

M:2000bpDNAMarker;1～3均为目的条带图1TY134菌株的16SrDNAPCＲ扩增电泳图Fig.1Electrophoresisof16SrDNAPCＲproductofactino-myceteTY134(NＲ042904)和KitasatosporaniigatensisNBＲC16453(AB249960)作为外围群，选取16株同属链霉菌的16SrDNA的序列作为参考菌株进行同源性比对分析，利用MEGA7．0软件、使用邻接法(Neighbour-Joining)构建TY134菌株与参考菌株16SrDNA的系统发育树显示，TY134菌株与Streptomycesfulvissi-musNBＲC13482(AB184434)、Streptomycestacrolimi-cusATCC55098(FN429653)处于同一分支上(见图2)。由此可以确认TY134菌株为极暗黄链霉菌Streptomycesfulvissimus。图2根据16SrDNA序列构建的菌株TY134系统发育树Fig.2PhylogenetictreeofthestrainTY134basedon16SrDNAsequences2．2抑菌试验利用菌饼法测定了放线菌TY134对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用(见表1)。由此得知，放线菌TY134对金黄色葡萄球菌、表1放线菌TY134菌株的抑菌活性Table1Anti-microbialactivityofactinomyceteTY134strain靶标菌Targetedpathogens放线菌TY134ActinomyceteTY134空白对照Blankcontrol(CK)金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus+－大肠杆菌Escherichiacoli++－枯草芽胞杆菌Ｒacillussubtilis+－白色念珠菌Candidaalbicans－－注:“++”表示有强烈的抑菌活性(抑菌直径＞15mm);“+”表示有抑菌活性(0＜抑菌直径＜15mm);“－”表示无抑菌活性。Note:“++”indicatedstronganti-microbialactivity(Diameter＞15mm);“+”indicatedmoderateanti-microbialactivity(Diameter＜15mm);“-”in-dicatednoanti-microbialactivity．1088天然产物研究与开发Vol.29

M:2000bpDNAMarker;1～3均为目的条带图1TY134菌株的16SrDNAPCＲ扩增电泳图Fig.1Electrophoresisof16SrDNAPCＲproductofactino-myceteTY134(NＲ042904)和KitasatosporaniigatensisNBＲC16453(AB249960)作为外围群，选取16株同属链霉菌的16SrDNA的序列作为参考菌株进行同源性比对分析，利用MEGA7．0软件、使用邻接法(Neighbour-Joining)构建TY134菌株与参考菌株16SrDNA的系统发育树显示，TY134菌株与Streptomycesfulvissi-musNBＲC13482(AB184434)、Streptomycestacrolimi-cusATCC55098(FN429653)处于同一分支上(见图2)。由此可以确认TY134菌株为极暗黄链霉菌Streptomycesfulvissimus。图2根据16SrDNA序列构建的菌株TY134系统发育树Fig.2PhylogenetictreeofthestrainTY134basedon16SrDNAsequences2．2抑菌试验利用菌饼法测定了放线菌TY134对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用(见表1)。由此得知，放线菌TY134对金黄色葡萄球菌、表1放线菌TY134菌株的抑菌活性Table1Anti-microbialactivityofactinomyceteTY134strain靶标菌Targetedpathogens放线菌TY134ActinomyceteTY134空白对照Blankcontrol(CK)金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus+－大肠杆菌Escherichiacoli++－枯草芽胞杆菌Ｒacillussubtilis+－白色念珠菌Candidaalbicans－－注:“++”表示有强烈的抑菌活性(抑菌直径＞15mm);“+”表示有抑菌活性(0＜抑菌直径＜15mm);“－”表示无抑菌活性。Note:“++”indicatedstronganti-microbialactivity(Diameter＞15mm);“+”indicatedmoderateanti-microbialactivity(Diameter＜15mm);“-”in-dicatednoanti-microbialactivity．1088天然产物研究与开发Vol.29

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌作用，而对白色念珠菌没有抑菌作用，说明该放线菌TY134菌株能够产生具有抑菌作用的代谢产物。2．3单培养与共培养发酵乙酸乙酯提取物的HPLC图谱分析以大米固体培养基作为发酵基质，将放线菌TY134和蝙蝠蛾拟青霉分别进行单培养和共培养发酵，发酵产物经乙酸乙酯超声提取，提取物经HPLC分析后结果见图3，其中A、B和C分别表示蝙蝠蛾拟青霉单培养发酵、二者共培养发酵、放线菌TY134单培养发酵乙酸乙酯提取物的HPLC分析图谱。从图3B明显可以看出，放线菌TY134与蝙蝠蛾拟青霉共培养图谱中，在保留时间Ｒt=14．143min处出现了一个新增的吸收峰，而在放线菌TY134(C)和蝙蝠蛾拟青霉(A)的单培养图谱中并没有这个吸收峰的出现。说明放线菌TY134与蝙蝠蛾拟青霉在共培养发酵过程中的相互作用使它们产生了新的次级代谢产物，起到了正调控的作用，因此，可以进一步推测共培养发酵可能会使某些沉默的生物合成基因簇得以激活。这一结论为今后微生物次生代谢产物的开发与利用提供了理论依据。图3蝙蝠蛾拟青霉单培养(A)、二者共培养发酵(B)及放线菌TY134菌株单培养(C)发酵产物的HPLC色谱图Fig.3HPLCchromatogramsoffermentationextractsofmonocultureofP．hepiali(A)，actinomyceteTY134(C)andtheirco-cul-ture(B)2．4重现性试验精密称取相同质量的放线菌TY134菌株与蝙蝠蛾拟青霉单培养和共培养的发酵产物，按照1．2．6项中步骤制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样测定。以保留时间Ｒt=14．143min处出现的新增吸收峰的峰面积值作为参考，计算该吸收峰含量测定的ＲSD值。试验结果表明:该吸收峰的ＲSD值为1．15%(＜3%)，表明重现性良好。2．5发酵产物提取物抑菌试验采用双层平板打孔法测定了蝙蝠蛾

本文编号：2798488