基于UPLC-QTOF MS技术的四物汤灌胃大鼠代谢组学初步研究

发布时间：2020-09-10 09:33

　　目的：建立SD大鼠血清、尿液固有成分标签库,用以区分内源性代谢物与外源性物质,为大鼠灌胃四物汤后的代谢组学研究提供基础；对大鼠进行单次和多次四物汤灌胃,展开血清、尿液代谢组学初步研究,探讨正常大鼠灌胃四物汤后血清、尿液代谢物的变化,并以内源性代谢物的变化情况探索四物汤的药效机制。方法：本研究主要采用UPLC-QTOF MS技术,对正常SD大鼠的血清、尿液成分进行检测。首先,通过自主建立的Searcher软件将实测结果与离线HMDB数据库相匹配,进而建立包括大鼠血清、尿液成分全部实测数据及预鉴别化学结构等多种信息在内的SD大鼠血清、尿液固有成分数据库;再利用UPLC-QTOF MS技术对单次和多次灌胃四物汤的SD大鼠血清、尿液进行检测,将给药组大鼠血清、尿液数据与空白组大鼠血清、尿液数据分别进行PCA, OPLS-DA分析,选取差异化合物与SD大鼠血清、尿液固有成分数据库进行匹配；最后对通过一级质谱精确质荷比分析得到的预鉴别结构进行与标准品比较,二级质谱碎片分析,进一步验证鉴别结果。结果：本研究建立了SD大鼠固有成分数据库,不仅包含大鼠血清、尿液成分的全部实测数据,还通过自主建立的预鉴别软件对数据进行分析处理。血清样品在正离子模式下得到950个有效信号,其中155个信号可推测化学结构；在负离子模式下得到1280个有效信号,其中190个可推测化学结构;得到15种经多态离子互证的化学成分。尿液样品在正离子模式下得到2260个有效信号,其中1060个可推测化学结构；在负离子模式下得到3000个有效信号,其中1270个可推测化学结构；得到92种经多态离子互证的化学成分。七个不同时间点四物汤单次灌胃给药后,在大鼠血清中共得到821种差异性成分,其中正离子模式下得到437种差异物,负离子模式下得到384种差异物。多次灌胃四物汤后,在大鼠血清中共得到182种差异性成分,正离子模式140种,负离子模式42种。通过与标准品比较和二级质谱分析,进一步验证了包含肌酸结构的化合物,柠檬酸,11-脱氢皮甾醇等多种内源性成分在血清中的含量发生了变化。单次和多次灌胃四物汤后的大鼠尿液中,正、负离子模式下共得到136种和77种差异化合物。通过二级质谱分析进一步验证了4-庚酮,癸二酸,3-Hydroxysebacic acid或2-Hydroxydecanedioic acid,甲基腺嘌呤,5-Hydroxy-6-methoxyindole glucuronide或6-Hydroxy-5-methoxyindole glucuronide, N-Acetyl-7-O-acetylneuraminic acid 及 Formylanthranilic acid或Noradrenochrome等多种成分在给予四物汤后在体内的含量产生了变化。结论：本研究建立了SD大鼠血清、尿液固有成分数据库,为进行四物汤灌胃后的大鼠代谢组学研究提供了前提条件,有效地区分了生物体内源性成分与四物汤药源性成分；鉴别并探讨了多种灌胃四物汤后在大鼠血清、尿液中发生含量变化的内源性成分及其生理意义,进一步推测了四物汤可能发挥的功效。本研究从内源性代谢物含量变化的角度为探讨四物汤的药理作用提供了参考。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R965;O657.63
【部分图文】：

偏最小二乘,灌胃给药,子模式,单次

２．３正交偏最小二乘辨别分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）逡逑２．３．１单次灌胃给药大鼠血清样品正交偏最小二乘辨别分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）逡逑图１３Ａ－Ｇ是正离子模式（ＥＳ＋）单次灌胃７个给药时间点下的给药组与空白逡逑组大鼠血清样品ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ邋ＭＳ数据ＯＰＬＳ－ＤＡ的Ｓ图（Ｓ－Ｐｌｏｔ）。图１４Ａ－Ｇ逡逑是负离子模式（ＥＳ－）单次灌胃７个给药时间点下的给药组与空白组大鼠血清样逡逑品ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦＭＳ数据ＯＰＬＳ－ＤＡ的Ｓ图（Ｓ－Ｐｌｏｔ）。Ｓ图中的每个点代表一个逡逑变量，即ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ邋ＭＳ上在某个保留时间出现的某个质荷比信号的强度。横逡逑坐标代表变量对模型的贡献度，越向两端分布贡献度越大；纵坐标代表变量的可逡逑信度，也就是变量与组别的相关性，越向两端分布可信度、与组别的相关性越大，逡逑取值在－１到１之间横坐标和纵坐标的正方向代表空白组信号强于给药组，逡逑负方向代表给药组信号强于空白组。Ｓ图中所标记的点，是横坐标绝对值＞逡逑０．００１，纵坐标绝对值＞０．８，’为标准选择出的差异性信号（ｍａｒｋｅｒ），共计８２１个，逡逑其中正离子模式（ＥＳ＋）邋４３７个，负离子模式（ＥＳ－）邋３８４个。正离子模式和负离逡逑子模式下的差异性信号（ｍａｒｋｅｒ）分别按不同趋势下贡献度（横坐标）的绝对值逡逑由大到小编号。逡逑Ｂ逦５５－－Ｊ５逡逑Ａ逦＂逦祖吊１．Ｗ邋巧■邋５１逡逑：：逦：逦萨一－．逡逑■邋．．．逡逑：；逦邋逦逦

偏最小二乘,灌胃给药,单次,负离子

２．３．１单次灌胃给药大鼠血清样品正交偏最小二乘辨别分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）逡逑图１３Ａ－Ｇ是正离子模式（ＥＳ＋）单次灌胃７个给药时间点下的给药组与空白逡逑组大鼠血清样品ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ邋ＭＳ数据ＯＰＬＳ－ＤＡ的Ｓ图（Ｓ－Ｐｌｏｔ）。图１４Ａ－Ｇ逡逑是负离子模式（ＥＳ－）单次灌胃７个给药时间点下的给药组与空白组大鼠血清样逡逑品ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦＭＳ数据ＯＰＬＳ－ＤＡ的Ｓ图（Ｓ－Ｐｌｏｔ）。Ｓ图中的每个点代表一个逡逑变量，即ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦ邋ＭＳ上在某个保留时间出现的某个质荷比信号的强度。横逡逑坐标代表变量对模型的贡献度，越向两端分布贡献度越大；纵坐标代表变量的可逡逑信度，也就是变量与组别的相关性，越向两端分布可信度、与组别的相关性越大，逡逑取值在－１到１之间横坐标和纵坐标的正方向代表空白组信号强于给药组，逡逑负方向代表给药组信号强于空白组。Ｓ图中所标记的点，是横坐标绝对值＞逡逑０．００１，纵坐标绝对值＞０．８，’为标准选择出的差异性信号（ｍａｒｋｅｒ），共计８２１个，逡逑其中正离子模式（ＥＳ＋）邋４３７个，负离子模式（ＥＳ－）邋３８４个。正离子模式和负离逡逑子模式下的差异性信号（ｍａｒｋｅｒ）分别按不同趋势下贡献度（横坐标）的绝对值逡逑由大到小编号。逡逑Ｂ逦５５－－Ｊ５逡逑Ａ逦＂逦祖吊１．Ｗ邋巧■邋５１逡逑：：逦：逦萨一－．逡逑■邋．．．逡逑：；逦邋逦逦

负离子,标准品,二级质谱,信号

图１８巧j#酸标准品与信号７５在负离子模式下的选择离子流图和二级质谱图谱逡逑Ａ：巧j#酸标准品负离子模式下ＴＯＦ邋ＭＳ选择离子流图；Ｂ：信号７５负商子模式下ＴＯＦ邋ＭＳ逡逑选择离子流图；Ｃ；巧j#酸标准品二级质谱图谱；Ｄ：信号７５二级质谱图谱逡逑Ｆｉｇ邋１８邋Ｓｅｌｅｃｔｅｄ邋ｉｏｎ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ邋ａｎｄ邋ｉ＊ｅｌａｔｅｄ邋ＭＳ／ＭＳ邋ｏｆ邋Ｃｉｔｒｉｃ邋ａｃｉｄ邋ａｎｄ邋Ｓｉｇｎａｌ邋＊７５邋ｉｎ邋ＥＳ—逡逑Ａ：邋Ｓｅｌｅｃ化ｄ邋ｉｏ打邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｉｎｓ邋ｏｆ邋Ｃｉｔｒｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｉｎ邋ＥＳ—；邋Ｂ：邋Ｓｅｌｅｃ记ｄ邋ｉｏｎ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ邋ｏｆ邋Ｓｉｇｎａｌ邋７５逡逑ｉｎ邋ＥＳ—；邋Ｃ：邋Ｃｉｔｒｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｒｅｌａ化ｄＭＳ／ＭＳ；邋Ｄ：邋Ｓｉｇｎａｌ邋７５邋ｒｅｌａ化ｄＭＳ／ＭＳ逡逑，巧逦巧Ｉ。逡逑ｒ．邋ｓ；；逡逑＂，邋Ａ：：逡逑’拍＜＾逦？巧邋１邋Ｋ逦，ｒ，扣’逦ｉ？．邋１，＂逡逑！？，２？逦，；》？：！：逦ｍ邋ＨＴ逡逑＊邋。化＾？，：》，逦b8心１邋广＊’：逦：？；，《逦…：＂逦…产Ｐ逡逑，．，；口逦Ｉ邋ｊｒ－Ｍ－逦Ｐ邋…：逡逑：：巧；：逦ｐ＊．，．Ｔ逦化‘化邋ｐｍ逡逑２７！邋１ＳＴ逦巧逦ＭＵ＇＂逡逑—，逡逑

【参考文献】