基于不同发酵方式的三株海洋微生物活性次级代谢产物研究

发布时间：2020-09-17 20:53

　　 本文对来源于近海滩涂、红树林土壤和深海沉积物的海洋样品进行分离纯化,共得到真菌102株,放线菌132株,细菌10株。通过对所有菌株发酵产物的TLC和HPLC分析及生物活性筛选,最终选取了 3株不同来源的海洋微生物,包括海洋链霉菌SS17F,红树林海洋链霉菌HNA101,深海海洋细菌SHA4,并对其进行了系统的次级代谢产物及生物活性研究。采用不同发酵方式对上述三株海洋微生物进行发酵培养,通过乙酸乙酯对发酵产物进行提取,综合运用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、MPLC、HPLC等方法对提取物进行分离纯化,运用NMR、LC-MS等技术对单体化合物的结构进行解析,并结合X-ray单晶衍射、ECD、Mosher、Marfey法等技术手段阐明了新化合物的立体构型。在菌株SS17F的不同发酵产物中分离得到17个化合物,其中新化合物5 个,分别是lactoquinomycin D(13)和thioquinomycins A-D(14-17)。从菌株HNA101的不同发酵产物中分离得到25个化合物,其中包括1 1个新化合物,2-methoxy-xanthorrhorrhoeol(22),EIQ(27),alokicenones A-I(34-42)和 1 个新的天然产物2-hydroxy-xanthorrhorrhoeol(20)。在菌株SHA4的次级代谢产物中分离得到12个化合物,包括1个新化合物acantimycic acid(54)和1个新的天然产物7-hydroxy-2H-1,4-benzothiazin-3(4H)-one(44)。活性研究显示,化合物14-17表现出了一定的抗肿瘤及蛋白激酶抑制活性化合物。化合物34和35表现出了显著的抗肿瘤活性和蛋白激酶抑制活性,对人结肠癌细胞SW620和HCT116的IC50值在0.63-3.49 μM之间。化合物54具有神经保护作用。研究发现,采用高氏一号液体培养基发酵时,具有培养周期短,微生物生长及代谢产物稳定等优点;而采用大米固体培养基发酵时,微生物次级代谢产物的产率及丰富度明显增加,更容易获得新的天然产物。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R915
【部分图文】：

逦逦逡逑培养基逦质量比逦海盐水（２．５。／。）逡逑＾逦４０ｇ逦６０邋ｍＬ逡逑②逦豆粕逦４０邋ｇ逦３０邋ｍＬ逡逑③逦大米：豆粕逦２０ｇ：２０ｇ逦５０逦ｍＬ逡逑④逦大米：麦麸逦２０ｇ：２０ｇ逦４０逦ｍＬ逡逑⑤逦豆粕：麦麸逦２０ｇ：２０ｇ逦３０逦ｍＬ逡逑将配置好的培养基，置于５００ｍＬ锥形瓶中，充分混匀，加塞封口后竖直放逡逑置于高压灭菌锅中，在１２１邋°Ｃ下湿热灭菌２０ｍｉｎ，取出，自然冷却后待用。逡逑将目标菌株少ｃｅｓ邋ｓｐ．邋ＳＳ１７Ｆ接种于上述８种培养基中，液体培养基逡逑采用２８邋°Ｃ，邋１８０邋ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养７天，固体培养基在２８邋°Ｃ恒温室内静置培逡逑养３０天。发酵完成后，液体培养基的发酵产物用等体积的乙酸乙酯进行萃取，逡逑固体培养的发酵产物则用乙酸乙酯浸提，每次浸泡２４小时；提取液经旋转蒸发逡逑仪减压浓缩并回收溶剂，所得浸膏即为不同培养基下的发酵产物。对各提取物进逡逑行ＨＰＬＣ邋（样品浓度：１０ｍｇ／ｍＬ）对比分析。逡逑ｕＶ（？１０Ｃ．０００＞逦ｕＶＩｘｌ邋．０００邋０００１逦逡逑

第２章海洋放线菌ＳＳ１７Ｆ次级代谢产物的研究逡逑结果显示，采用高氏一号培养基作为液体培养基时，发酵培养所得的代谢产逡逑物更加丰富（图２．１Ａ），且产率最高，抗肿瘤活性最好（图２．２）。固体培养基逡逑中，大米培养基作为固体培养基时，产物更为丰富（图２．１Ｂ），产率较高（图逡逑２．２）；而采用豆粕作为培养基时，虽然也能在ＨＰＬＣ图谱中观察到较为丰富的逡逑产物，但由于豆粕自身的很多物质被提取出来，造成油脂含量偏高，粗提物的生逡逑物活性大大降低，也不利于后续代谢产物的分离；培养基中加入麦麸后，微生物逡逑的生长速度变慢，和单一培养基相比，代谢产物的丰富度和产率也都减少了。因逡逑此，选择高氏一号液体培养基和大米固体培养基作为两种不同的发酵方式，进行逡逑下一步的研究。逡逑■产率（ｍｇ／瓶）逦■抑制率／％邋（１０ｕｇ／ｍＬ）逡逑６０逦Ｈ逦Ｈ逦＾逦ｈ逡逑５０逦■－逡逑３0邋ｊ邋｜邋Ｊ邋■逡逑＼邋■，邋■邋ＭＭ，邋１，邋■，邋１Ｊ逡逑＾邋＾邋＾邋＾邋＃邋＃逡逑图２．２不同培养基中菌株ＳＳ１７Ｆ发酵产物的产率和对肿瘤细胞ＮＣＩ－Ｈ１９７５的抑制率逡逑２．１．２不同发酵方式的研究逡逑进一步对两种发酵方式进行对比

浙江大学硕士学位论文逦第２章海洋放线菌■Ｓｆｒｅｐｏｗｙｅ；邋ｓｐ．邋ＳＳ１７Ｆ次级代谢产物的研究逡逑此有必要对大米培养基的发酵周期进行探究。实验中，保持温度不变，以１０、逡逑２０、３０、４５和６０天为培养周期对菌株ＳＳ１７Ｆ在大米培养基中的代谢产物丰富度逡逑和产量进行评估（图２．４）。结果表明，在不同的培养时间下，代谢产物丰度及产逡逑量呈现随发酵时间先上升后趋于稳定甚至略有降低的崷势，结合肉眼观察到的微逡逑生物生长状态和大米培养基的消耗情况，最终确定菌株ＳＳ１７Ｆ在大米培养基中逡逑的最适宜培养周期为３０天。逡逑ｙｕｉｗａｗｉ逦逡逑

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本文编号：2821225